Onkologické ochorenia sú podľa štatistík druhou najčastejšou príčinou mortality v Európe.[1] To dokumentuje nielen zdravotnícky ale aj celospoločenský význam týchto ochorení, ktoré predstavujú obrovskú záťaž pre jednotlivca ako aj pre celý zdravotnícky a sociálny systém. Navyše, vplyvom rastu a starnutia populácie sa incidencia týchto ochorení bude v nasledujúcich rokoch významne zvyšovať. Preto je veľmi dôležité rozširovať spektrum terapeutických možností, hľadať nové prostriedky a spôsoby liečby onkologických ochorení a skúmať nové látky a molekuly s možným protirakovinovým účinkom. Jednou z možností kde tieto látky hľadať sú rastliny používané vo východnej medicíne a tradičnom liečiteľstve. Viacero rôznych látok s antiproliferatívnym účinkom na rakovinové bunky už bolo objavených práve v rastlinách používaných v alternatívnej medicíne a fytoterapii.[2,3] Ako príklady môžeme uviesť antiproliferačný a antioxidačný účinok Garcinia mangostana na líniu buniek rakoviny prsníka[4] alebo indukciu apoptózy ľudských buniek rakoviny pľúc kurkumínom.[5] Annona muricata (anona mäkkoostnatá, graviola, soursop) je rastlina z čeľade anonovité. Vyskytuje sa v Ázii, Oceánii, Strednej a Južnej Amerike a v Afrike. V prírodnej medicíne sa listy a semená používajú ako prostriedky proti parazitom, vysokému krvnému tlaku a rakovine. Viaceré vedecké práce udávajú antiproliferačné účinky anonacenových acetogenínov, látok extrahovaných zo semien a listov tejto rastliny, na vybrané rakovinové bunkové línie.[6,7] V našom experimente sme sa zamerali na protirakovinový efekt výluhu Annona muricata, na sledovanie jeho vplyvu na proliferáciu buniek rakovinovej línie HT-29 (adenokarcinóm hrubého čreva) a indukciu apoptózy v tejto bunkovej línii pomocou testov cytotoxicity (MTT, WST-1) a apoptózy (Muse™ Annexin V and Dead Cell Assay). Z našich meraní vyplynulo, že roztok vytvorený vyluhovaním listov rastliny Annona muricata v PBS pri 80˚C počas 20 minút mal značný vplyv na proliferáciu a indukciu apoptózy v bunkovej línii HT-29 len v 100% koncentrácii, menej výrazný bol vplyv 50% koncentrácie (výluh rastliny v PBS zriedený s DMEM v pomere 1:1). Pri nižších koncentráciách neboli pozorované výraznejšie zmeny. Z výsledkov usudzujeme, že látky prítomné v listoch tejto rastliny indukujú apoptózu a znižujú proliferáciu v použitej bunkovej línii. Do budúcnosti plánujeme zopakovať experiment s použitím metanolového extraktu. Tiež plánujeme uskutočniť chemickú analýzu použitého extraktu. Listy tejto rastliny majú podľa našich meraní antiproliferatívne účinky na bunky adenokarcinómu hrubého čreva a mohli by byť použité pri vývoji nových chemoterapeutík.
[1] Data and statistics WHO Europe In: [online]. [cit. 2014-04-22]. Dostupné z: http://www.euro.who.int/en/health-topics/noncommunicable-diseases/cancer/data-and-statistics
[2] Shoemaker, M., Hamilton, B., Dairkee, S. H., Cohen, I. and Campbell, M. J. (2005), In vitro anticancer activity of twelve Chinese medicinal herbs. Phytother. Res., 19: 649–651. doi: 10.1002/ptr.1702.
[3] Lee, S. M. Y., Li, M. L. Y., Tse, Y. C., Leung, S. C. L., Lee, M. M. S., Tsui, S. K. W., ... & Waye, M. M. Y. (2002). < i> Paeoniae Radix, a Chinese herbal extract, inhibit hepatoma cells growth by inducing apoptosis in a p53 independent pathway. Life sciences, 71(19), 2267-2277.
[4] Moongkarndi, P., Kosem, N., Kaslungka, S., Luanratana, O., Pongpan, N., & Neungton, N. (2004). Antiproliferation, antioxidation and induction of apoptosis by< i> Garcinia mangostana(mangosteen) on SKBR3 human breast cancer cell line. Journal of ethnopharmacology, 90(1), 161-166.
[5] Radhakrishna Pillai, G., Srivastava, A. S., Hassanein, T. I., Chauhan, D. P., & Carrier, E. (2004). Induction of apoptosis in human lung cancer cells by curcumin. Cancer letters, 208(2), 163-170.
[6] George, V. C., Kumar, D. N., Rajkumar, V., Suresh, P. K., & Ashok, R. (2012). Quantitative assessment of the relative antineoplastic potential of the n-butanolic leaf extract of Annona muricata Linn. in normal and immortalized human cell lines. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 13(2), 699-704.
[7] Wu, F. E., Gu, Z. M., Zeng, L., Zhao, G. X., Zhang, Y., McLaughlin, J. L., & Sastrodihardjo , S. (1995). Two New Cytotoxic Monotetrahydrofuran Annonaceous Acetogenins, Annomuricins A and B, from the Leaves of Annona muricata. Journal of Natural Products, 58 (6), 830-836.
... zopar otazok
Ahoj, rad by som sa spytal niekolko otazok k tvojej praci.
- Co znamenaju skratky DMEM a PBS, ktore si pouzila v prezentacii?
- Predpokladam, ze DMEM a PBS su nejake vodne roztoky. Acetogeniny su pomerne lipofilne latky, ich rozpustnost ve vode nebude vysoka. Pokusili ste sa nejako dokazat, ze pripraveny roztok obsahoval naozaj ocakavane acetogeniny?
- Kolko roznych extraktov bolo testovanych?
- Je zname, ze obsah acetogeninov kolise vyrazne (radovo) pocas roka v ramci jednej rastliny, ale kolise zaroven aj medzi jednotlivymi rastlinami. Pokusali ste sa nejako standardizovat obsah acetogeninov v surovine, ktoru ste extrahovali?
- V testoch MTT a WST sa extrakt 100% chova radikalne inac, nez ostatne. Ako si to vysvetlujes?
Dakujem a prajem vela uspechov do buducna.
Re: ... zopar otazok
Ahoj, ďakujem za otázky.
Skratka DMEM znamená Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium a je to médium používané na kultiváciu buniek obsahujúce aminokyseliny, soli, vitamíny a glukózu. PBS je skratka pre Phosphate Buffered Saline, co je vlastne pufrovaný fyziologický roztok. Máš teda pravdu že oba sú vodné roztoky. Čo sa acetogenínov týka - bol to len príklad z literatúry, že rastlina Annona muricata obsahuje látky s dokázaným antikancerogénnym efektom. Nám v našom experimente ale nešlo o dokázanie ich prítomnosti ani účinku týchto konkrétnych látok, ale výluhu ako takého. Každopádne máme v pláne urobiť analýzu výluhov a stanoviť prítomné látky a ich koncentrácie. Tiež plánujeme pripraviť a testovať ďalšie výluhy s použitím iného rozpúšťadla. Rada si nechám poradiť aké použiť, ak máš nejaký tip.
Čo sa týka rozdielu hodnôt v MTT a WST-1 medzi 100% výluhom a ostatnými - je to dané tým, že napr. 50% výluh je vlastne polovične zriedený 100% a tým pádom účinných látok je o polovicu menej. To spôsobuje menší účinok na bunky. Ďalší faktor ktorý spôsobuje rozdiel v týchto hodnotách je podľa mňa fakt, že bunky v skorej fáze apoptózy (ktorých je pri 50% výluhu celkom veľa, viď graf apoptózy) boli testami MTT a WST-1 ešte zachytené ako živé.
Dúfam, že si spokojný s odpoveďami a ak máš ešte ďalšie otázky, rada na ne odpoviem.
Otázka
Dobrý deň, veľmi zaujímavá práca. Chcem sa preto opýtať prečo ste si vybrali v experimente bunkovú líniu adenokarcinómu hrubého čreva, očakávali ste práve u tohto typu vyššiu účinnosť?
V prezentácii nie je uvedené (nenašiel som) z koľkých nezávislých opakovaných meraní sú získané prezentované výsledky. ďakujem
Re: Otázka
Dobrý deň, ďakujem. Bunkovú líniu HT-29 sme si vybrali z jednoduchého dôvodu. Bola k dispozícii. Neočakávali sme vyššiu účinnosť. Momentálne skúmame efekt tohto výluhu aj na iných bunkových líniách a teda časom budeme vedieť účinnosť na jednotlivé línie porovnať.
Všetky merania boli opakované 3 krát.
Ďakujem za otázky, ak máte ešte nejaké, rada ich zodpoviem.