Nádorové ochorenia majú nielen na Slovensku ale aj vo svete stúpajúci charakter, a preto vzrastá potreba hľadať stále nové protinádorovoaktívne látky na liečbu týchto ochorení. Charakter nádorového ochorenia a jeho rozmanité formy určujú spôsob liečby, ktorý v súčasnosti predstavuje zväčša kombináciu základných terapeutických metód. Najčastejšie používaná je chirurgická liečba a liečba ožarom (rádioterapia, fotodynamická terapia). V súčasnosti existuje na liečbu nádorových ochorení široké spektrum liečiv s cytotoxickým účinkom, ktorý je však možné zvýšiť žiarením. Takéto látky, citlivé na žiarenie, sa nazývajú fotosenzitizéry (1,2). Fotosenzitizéry absorbujú svetlo vo viditeľnej alebo infračervenej oblasti spektra. Po aktivácii môže fotosenzitizér emitovať svetlo (fluorescenciu), podstúpiť fotochemické reakcie typu I (elektrónový alebo vodíkový prenos) alebo typu II (tvorba singletového kyslíka- 1O2). Tieto reakcie vedú k oxidačnému poškodeniu proteínov, lipidov a DNA, výsledkom čoho je apoptózová alebo nekrózová smrť buniek, závislá od fotosenzitizéra, bunkového typu a ovplyvňujúceho procesu (3,4).
Chinazolín a jeho deriváty sú zlúčeniny, ktoré sa vzhľadom na široké spektrum ich biologických účinkov, používajú vo farmaceutickom priemysle, v medicíne aj v poľnohospodárstve. 4-anilínochinazolíny sú derivátmi chinazolínu, patria do triedy inhibítorov epidermálneho rastového faktoru tyrozín kinázového receptoru (EGFR -TK) a sú často využívané na liečbu rôznych druhov nádorových ochorení (5). Na základe ich biologickej aktivity zaraďujeme tieto zlúčeniny do skupiny fotosenzitizérov.
Normálna bunka za fyziologických podmienok prekonáva určité funkčné a morfologické zmeny, ktoré sú dané jej genetickým programom, čím reaguje na požiadavky svojho metabolizmu. Ak je však záťaž z prostredia veľká alebo adaptácia z určitých dôvodov nie je možná, dochádza k poškodeniu, ktoré môže končiť jej smrťou. Bunková smrť sa často definuje ako nevratný proces, pri ktorom dochádza k zastaveniu biochemických procesov v bunke a následne k porušeniu jej štruktúry. Rozoznávame štyri základné druhy bunkovej smrti – apoptózu, autofágiu, mitotickú katastrofu a nekrózu. Nekróza je považovaná za proces, ku ktorému dochádza po vyčerpaní zásob ATP, s následnou stratou integrity membrány a uvoľnením vnútrobunkového obsahu do prostredia.
V našom laboratóriu sme sa najskôr v rámci primárneho skríningu zaoberali cytotoxickým/fototoxickým účinkom nového 4-anilínochinazolínového derivátu - N-2-difenyl-4-aminochinazolín na ľudskú nádorovú bunkovú líniu HeLa izolovanú z krčka maternice. Zistili sme, že antiproliferačná aktivita tohto derivátu počas 24, 48 a 72h pôsobenia na bunky stúpala úmerne s jeho stúpajúcou koncentráciou pričom prítomnosť UVA žiarenia zvyšovala účinok látky, čo sa prejavilo aj na morfológii buniek. Na základe uvedeného, bolo cieľom našej práce sledovať rôznymi metódami spôsob smrti nádorových HeLa buniek spôsobenej vybranými koncentráciami 4-anilínochinazolínového derivátu bez/v prítomnosti UVA počas 24, 48 a 72h pôsobenia. Na sledovanie bunkovej smrti sa použila elektroforetická detekcia internukleozomálneho štiepenia DNA a fluorescenčná mikroskopia s použitím fluorescenčných farbív Hoechst 33258 a propídium jodid. Najskôr sme pozorovali schopnosť nefotoaktivovaného/fotoaktivovaného derivátu vyvolať internukleozomálne štiepenie celulárnej DNA pomocou gélovej elektroforézy. Ako pozitívna kontrola sa použila cis-platina (koncentrácia 6 μM). Po 24, 48 a 72h vplyve derivátu sa v porovnaní s pozitívnou kontrolou nezistila žiadna tvorba „DNA rebríka“ ani pri jednej z testovaných koncentrácií 4-anilínochinazolínového derivátu bez/v prítomnosti UVA žiarenia. Fluorescenčná mikroskopia ukázala, že kontrolné bunky nemali porušenú cytoplazmovú membránu a ani sa nefarbili PI na červeno. Na druhej strane, HeLa bunky ovplyvnené nefotoaktivovanými a fotoaktivovanými koncentráciami derivátu (v rozpätí 10,5 μM - 84,1 μM) boli zafarbené PI na červeno.
Pri sledovaní účinku nefotoaktivovaného/fotoaktivovaného N-2-difenyl-4-aminochinazolínu na myších leukemických bunkách L1210 sme zistili, že derivát indukuje koncentračne závislú apoptózovú smrť vnútornou mitochondriovou dráhou.
Na základe uvedených výsledkov možno konštatovať, že HeLa bunky ovplyvnené cytotoxickými/fototoxickými koncentráciami N-2-difenyl-4-aminochinazolínu zomierajú v závislosti od typu bunkovej línie nekrózovou/apoptózovou bunkovou smrťou.
Táto štúdia vznikla vďaka podpore z projektu Vega č. 1/0041/15.
(1) Chandregowda, V., Kush, A. K., Reddy, G. C.: Synthesis and in vitro antitumor activities of novel 4-anilinoquinazoline derivatives. European journal of medicinal chemistry 44, 2009, s.3046-3055.
(2) Bianco, R., Melisi, D., Ciardiello, F., Tortora, G.: Key cancer cell signal transduction pathways as therapeutic targets. Eur. J. Cancer. 42, 2006, s.290-294.
(3) Dougherty, T.J., Gomer, C.J., Henderson, B.W., Jori, G., Kessel, D., Korbelik, M., Moan, J., Peng, Q.: Photodynamic therapy. J. Natl Cancer Inst. 90, 1998, s.889-905.
(4). Zimmermann, A., Walt, H., Haller, U., Baas, P., Klein, S.D.: Effects of chlorin-mediated photodynamic therapy combined with fluoropyrimidines in vitro and in a patient. Cancer Chemother Pharmacol. 51, 2003, s.147-154.
(5) Hai-Yan, S., Su, G., Hui-Chang,B.I., Qi-Biao, S., Wen-Lin, H., Balram, CH., Min, H., Xiao, CH., Chun-Guang, L., Shu-Feng, Z.: Determination of CH330331, a novel 4-anilinoquinazoline inhibitor of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase, in human Caco-2 monolayers by high performance liquid chromatography with ultraviolet detection: Application to a trans-epithelial transport study. J. of Chromatography B 854, 2007, s.320-327.
otázočky
Mám otázku ohľadne záveru, kde je spomenuté "derivát indukuje koncentračne závislú apoptózovú smrť
vnútornou mitochondriovou dráhou". Moja otázka je ako viete, že to išlo vnútornou dráhou? Sledovali ste úmrtnosť buniek a viete povedať aký bol rozsah/pomer apoptózy a nekrózy buniek? Ak by prevládla nekróza, nemohlo by to mať negatívny účinok na terapiu?
Re: otázočky
Dobrý deň prajem,
v prvom rade ďakujem za Váš záujem o problematiku a otázky. V elektroforetickej detekcii fragmentácie DNA spomíname, že ako pozitívnu kontrolu sme použili bunky L1210 a teda v tomto prípade sme zaznamenali fragmentáciu DNA, ku ktorej dochádza v prípade smrti apoptózou. V ďalších už neprezentovaných výsledkoch sme zistili, že tieto bunky L1210 skutočne umierajú apoptózou, čo sme dokázali napr. pomocou aktivácie kaspáz 8 a 9. Z toho dôvodu sme ich mohli použiť ako "štandard" a pozitívnu kontrolu v prípade inej bunkovej línie u ktorej sme rovnakou metódou (teda v tomto prípade elektroforetickou detekciou) sledovali spôsob smrti buniek. Nakoľko u HeLa buniek nedošlo k fragmentácii DNA a pri fluorescenčnom farbení sa farbili propídium jodidom, smrť apoptózou sme mohli predbežne vylúčiť. Výsledky ukazujú že bunky umierali nekrózou avšak ešte prebiehajú ďalšie experimenty kde by sme tento typ smrti definitívne potvrdili. Samozrejme, ideálny prípad by bol keby vplyvom našej látky prechádzali nádorové bunky do apoptózy, avšak ukazuje sa že naša látka mala na HeLa bunky nekrotický účinok. Z toho dôvodu sme v závere príspevku v rámci "krátkej diskusie" načrtli, že náš testovaný derivát síce spôsoboval u HeLa buniek nekrózu avšak u iného typu bunkovej línie spôsoboval apoptózu, ktorú sme dokázali rôznymi metódami.
oprava
Dobry den, (nanovo som nacitala otazky nakolko ma vyhodilo zo systemu):
1) preco ste ako pozitivnu kontrolu nepouzili priamo HeLa bunky ovplyvnene cis-platinou?
2) Preco ste pri farbeni nepouzili rovno farbenie PI+Annexin V na rozlisenie, skorych ap...optotickych a apototickych buniek, pripadne zivych.
3) co presne znamena fragmentacia DNA - pozorovali ste stiepenie proteinu PARP?
4) je mozne vyvolat PDT v nesvietenych bunkach priamo pri ziskavani obrazkov buniek pomocou fluorescencnej mikroskopie?
Dakujem za odpovede a drzim palce.