Chitinázy, hydrolytické enzýmy zabezpečujúce štiepenie β-1,4-glykozidových väzieb lineárneho biopolyméru chitínu, sú perspektívnym objektom záujmu pre moderné biotechnológie. Enzymatická aktivita chitináz môže byť využitá pri biodegradácií chitínového odpadu, pri zvyšovaní rezistencie rastlín voči fytopatogénom pomocou metód moderného šľachtenia, a taktiež vo farmaceutickom priemysle, kedy sa sleduje bioaktivita oligomérnych produktov štiepenia chitínu chitinázami [1].

Rosička okrúhlolistá (Drosera rotundifolia L.), mäsožravá rastlina z čeľade Droseraceae, rod Drosera, je zaujímavým genetickým zdrojom chitináz. Rosička okrúhlolistá je rastlinou so silnou antifungálnou aktivitou, jej chitinázy sú schopné štiepiť chitín obsiahnutý v bunkových stenách mikroskopických húb a tým inhibovať ich rast [2]. Štúdie naznačujú, že droserová chitináza je navyše zapojená v metabolických procesoch trávenia hmyzej koristi [3].

V práci sme sa zamerali na purifikáciu „over“-exprimovanej droserovej chitinázy (SChit) za natívnych podmienok. Rekombinantná chitináza bola produkovaná transformovanými bunkami expresného kmeňa E. coli BL21-Codon⁺ (DE3)-RIPL.

Predchádzajúca štúdia naznačila, že rekombinantná chitináza je produkovaná v nerozpustnej forme inklúznych teliesok [4]. Pre účely purifikácie za natívnych podmienok bolo potrebné získanie rekombinantného proteínu v rozpustnej proteínovej frakcií. Obohatenie výrobcom odporúčaného lyzačného roztoku pre purifikáciu za natívnych podmienok o 2% (w/v) dodecylsíran sodný (SDS) zabezpečilo uvoľnenie SChit proteínu z inklúznych teliesok do rozpustnej proteínovej frakcie.

Purifikácia bola realizovaná afinitnou chromatografiou na Ni-NTA agaróze. Limitná hodnota obsahu SDS v roztokoch nanášaných na Ni-NTA agarózu je výrobcom stanovená na 0,3%. Obsah SDS v lyzačnom roztoku s rekombinantným SChit proteínom sme znížili pod limitnú hodnotu jeho ochladením, kedy došlo k vyzrážaniu SDS, a následnou centrifugáciou.

Po úspešnej purifikácií rekombinantného SChit proteínu sme detekovali jeho enzymatickú aktivitu na polyakrylamidových géloch s prídavkom 1% (v/v) glykolchitínu [5]. Aktívny enzým štiepil β-1,4-glykozidové väzby glykolchitínu, čo sa prejavilo v podobe tmavých škvŕn na fluoreskujúcom pozadí.

Na základe dosiahnutých výsledkov môžeme zhodnotiť úspešnú purifikáciu rekombinantného SChit proteínu na Ni-NTA agaróze, ktorá navyše vykazuje jednoznačne detekovateľnú enzymatickú aktivitu. Ďalšie experimenty budú zamerané na enzymatické, substrátové a antifungálne charakteristiky rekombinantnej chitinázy.