Testovanie citlivosti primárnej bunkovej línie DFSC na statíny

Testovanie citlivosti primárnej bunkovej línie DFSC na statíny

Celkové hodnotenie

Vedecká práca
100%
Prevedenie (dizajn)
98%
Diskusná interakcia
100%
ISBN: 978-80-972360-6-9

Testovanie citlivosti primárnej bunkovej línie DFSC na statíny

Janka Pálešová1 , Romana Záhumenská , Terézia Okajčeková , Marián Kasaj2 , Ján Strnádel3 , Dagmar Statelová , Henrieta Škovierová , Erika Halašová4 ,
1 Ústav lekárskej biochémie, Univerzita Komenského v Bratislave, Jesseniova lekárska fakulta v Martine
2 Klinika stomatológie a maxilofaciálnej chirurgie UNM
3 Martinské centrum pre biomedicínu, Univerzita Komenského v Bratislave, Jesseniova lekárska fakulta v Martine
4 Ústav lekárskej biológie, Univerzita Komenského v Bratislave, Jesseniova lekárska fakulta v Martine
Jankasopkova.mt@gmail.com

Dospelé zubné kmeňové bunky majú výbornú schopnosť proliferácie a diferenciácie do iných typov tkanív v rámci svojej zárodočnej vrstvy. V súčasnosti si úspešná terapia kmeňovými bunkami vyžaduje regulovanú proliferáciu a diferenciáciu kmeňových buniek. Jedným z týchto regulátorov sú aj statíny. Tieto liečivá znižujú hladinu cholesterolu v krvi a to inhibíciou kľúčového enzýmu v biosyntéze cholesterolu, 3-hydroxy-3-metylglutaryl koenzým A reduktázy. Statíny sa využívajú pri liečbe kardiovaskulárnych ochorení pretože negatívne ovplyvňujú syntézu cholesterolu. Zároveň sa potvrdil ich pleitropný účinok na proliferáciu ako aj diferenciáciu. Pri aplikácii v nízkych koncentráciách sú statíny schopné zlepšiť prežívanie kmeňových buniek.

V našej práci sme použili de novo pripravenú primárnu bunkovú líniu z tkaniva dentálneho folikulu. Bunky sme charakterizovali na základe expresie špecifických CD markerov typických pre mezenchymálne kmeňové bunky. Potvrdili sme ich diferenciačný potenciál na chodrocyty, adipocyty a osteoblasty. Následne sme testovali časovú a koncentračnú závislosť vplyvu simvastatínu na zubné kmeňové bunky spektrofotometricky pomocou testu cytotoxicity - MTT testom a prietokovou cytometriou – anexínová esej. Stanovili sme IC 50 pre simvastatín. Takouto koncentráciu sme ovplyvnili zubné kmeňové bunky a analyzovali sme expresiu špecifických génov.

Potvrdili sme že simvastatín v nižších koncentráciách zvyšuje proliferáciu DFSC a vo vyšších koncentráciách indukuje apoptózu DFSC.

Poďakovanie: 

Táto práca bola podporená Agentúrou na podporu výskumu a vývoja APVV–15-0217, a grantom VEGA 1/0178/17.

Zdroje: 

Diskusia

Dobrý deň. Rada by som sa spýtala otázky k vašej práci.
Čo boli kontrolné bunky pri kultivácii DFSC v diferenciačných médiách?
Prečo ste pri test viability a rastových krivkách použili viacero koncentrácii simvastatínu, no pri anexínovej eseji len jednu? Bolo by zaujímavé potvrdiť lepšie prežívanie DFSC s nízkymi koncentráciami simvastatínu aj týmto testom, kde by bolo možné vidieť nižšie percento apoptotických buniek.
Pri test viability by som kvôli prehľadnosti zvolila na os x radšej spomenuté 4 časy a rozdielnu legendu pre rozdielne koncentrácie. Predpokladám, že bunky bez ovplyvnenia simvastatínu nemali 100% viability, preto by bolo zaujímavé ukázať absolútne hodnoty. Keby viabilita neovplyvnených buniek bola napr. pod 90%, znamená to, že celkovo ich viabilita nie je dobrá a to môže ovplyvniť štatistiku testu.
Chcela by som dodať jednu vec, čo sa týka expresie génov Bcl2, P53... Na sledovanie expresie génov sa používa zvyčajne metóda kvantitatívnej PCR (qPCR)a nie reverznej PCR (RT-PCR). Ak sa nemýlim, qPCR vie ukázať zvýšenú/zníženú expresiu génu, zatiaľ čo pri RT-PCR mohlo byť množstvo RNA ovplyvnené celkovým množstvom izolovanej RNA a teda výsledky môžu byť skreslené.
Budem rada za vaše odpovede a prajem všetko dobré.

Ďakujem za podnetné otázky a pripomienky.
Čo sa týka diferenciácie tak použitá bola primárna bunková línia DFSC kultivovaná v DMEM s vyšším obsahom glukózy, 10% FBS a 1 % P/S. Bunky boli pasážované a rozdelené do 4 skupín, pričom každá skupina bola ďalej kultivovaná v inom type kultivačného média (osteogénne diferenciačné/adipogénne diferenciačné/chondrogénne diferenciačné/pôvodné DMEM). Ako kontrolné bunky bola označená skupina buniek ktorá bola kultivovaná v pôvodnom rastovom médiu.
Cytotoxický test viability (MTT) nám mal ukázať vplyv simvastatínu v rôznych koncentráciách na DFSC v porovnaní s neovplyvnenými bunkami. Potrebovali sme určiť vhodnú koncentráciu, ktorá bunky ovplyvní, ale súčasne ich neusmrtí a mohla by byt použitá pre následné experimenty. Tiež sme chceli určiť IC 50 pomocou rastovej krivky. Vychádzali sme z výsledkov MTT testu a sledovali sme už len koncentrácie simvastatínu 0,05µmol/L 5 µmol/L. Na základe výsledkov ďalej pracujeme s koncentráciou 5 µmol/L a anexínovu esej sme použili, aby sme mali prehľad o zastúpení apoptotických buniek v populácii buniek so simvastatínom/bez simvastatínu, je to v podstate príprava pre ďalšie plánované experimenty, okrem iného aj qPCR.
Zmeniť os x je dobrý nápad, určite sa na to pozriem aj z tohto uhlu, ďakujem za nápad.