Využitie hmotnostnej spektrometrie v proteomickej analýze vzorky srdca po 1D gélovej elektroforéze

Využitie hmotnostnej spektrometrie v proteomickej analýze vzorky srdca po 1D gélovej elektroforéze

Celkové hodnotenie

Vedecká práca
93%
Prevedenie (dizajn)
97%
Diskusná interakcia
93%
PoužívateľVedecká prácaDizajnDiskusná interakcia
Eva Homzová100%100%100%
Mgr. Veronika Farkašová PhD.100%100%-
Bc. Petra Budinská100%100%-
Mgr. Veronika Oravczová100%100%-
Matúš Andel100%100%100%
Bc. Jana Bocková60%80%80%
ISBN: 978-80-972360-1-4

Využitie hmotnostnej spektrometrie v proteomickej analýze vzorky srdca po 1D gélovej elektroforéze

Natália Andelová1 , Barbara Szeiffová Bačová2 , Veronika Farkašová , Ivana Kancirová , Magdaléna Jašová , Miroslav Ferko ,
1 Katedra jadrovej fyziky a biofyziky FMFI UK, Bratislava, Slovensko
2 Ústav pre výskum srdca, SAV, Bratislava, Slovensko
nat.andelova@gmail.com

Cieľom práce je poskytnúť základné informácie o možnostiach využitia hmotnostnej spektrometrie (MS) v proteomickej analýze vzorky srdca. Proteomické prístupy sa v súčasnosti ukazujú byť ako jedným z dôležitých nástrojov pre hľadanie nových potenciálnych proteínových a peptidových markerov.

Pre samotnú prípravu vzorky sme použili metódu štiepenia proteínov na kratšie peptidové úseky. Po elektroforetickej separácii v 10% polyakrylamidovom géli boli proteíny vyrezané z gélu ako tzv. spoty o veľkosti 2x2 mm (výrez zodpovedá molekulovej hmotnosti 35-50 kDa) a následne podrobené enzymatickému štiepeniu. Pre zisk kvalitného fondu peptidov sme rozrušili terciárnu a kvartérnu štruktúru proteínov redukciou disulfidových väzieb a tým zabránili ich reoxidácii procesom alkylácie. Na redukčné štiepenie sa použil roztok DTT (c = 10 mmol/l), následná alkylácia bola prevedená roztokom iodoacetamidu (c = 55 mmol/l). Najčastejšie používaným enzýmom na štiepenie proteínu na peptidy je pre jeho dobrú použiteľnosť a vysokú špecificitu trypsín. K vysušeným spotom sa pridal roztok trypsínu (c = 0,02 mg/ml).  Vzorka bola následne podrobená MS analýzou s využitím iónového zdroja ESI. Samotný princíp metódy MS spočíva v meraní pomeru hmotnosti m a náboja z analyzovanej látky. Po nástreku vzorky dochádza k ionizácii, pričom molekula dostáva náboj. Následne dochádza k separácii nabitých častíc v analyzátore podľa ich pomeru m/z. Častice nakoniec dopadajú na detektor. Výsledkom je hmotnostné spektrum (závislosť intenzity na m/z). Pre uchovanie relevantných proteomických údajov a korelačnú analýzu sme využili softvérovú platformu Proteinscape. Ako vyhľadávací nástroj pre identifikáciu proteínov bol použitý Mascot server.

V pilotnej štúdii sme analyzovali vzorky z cytozolovej frakcie izolované z ľavej komory srdca potkanov kmeňa Wistar. Zvolenou metodikou sme identifikovali 8 proteínov v spote. Jednotlivé analýzy prebiehali duplicitne. Na overenie získaných výsledkov budú v rámci opakovania experimentov jednotlivé vzorky hodnotené triplicitne - v sérii 3 nezávislých meraní.

Proteomické analýzy v oblasti kardioprotekcie sa ukazujú byť perspektívnou voľbou pre identifikáciu proteínov ako potenciálnych kardiomarkerov. Nemenej významným uplatnením je ich využitie pri vytváraní proteínových máp pri charakterizovaní rozdielov v podmienkach fyziologických a patologických stavov.

Poďakovanie: 

Tento projekt bol podporený grantami: APVV 15-0119; VEGA 2/0133/15; Structural funds and Cohesion Fund (ITMS) 26230120006.

Zdroje: 

Diskusia

Dobrý deň Natália, gratulujem k peknej práci. Aj keď to nebolo priamym cieľom práce, rada by som sa opýtala, aké vlastnosti by mal mať potenciálny kardiomarker? (Na molekulovej úrovni). Ďakujem a želám veľa úspechov.
iwa

Ďakujem pekne za otázku. Všeobecne platí, že akýkoľvek biomarker je indikátorom normálnych a patogénnych procesov, ktorý môže prispieť v diagnostike, prípadne pri vytváraní skríningu ochorenia/poškodenia resp. identifikácii potenciálnej ochrany. Je rozdiel či ide o diagnostický marker – rozpoznáva ochorenie, alebo prognostický. Ideálny kardiomarker by mal byť pri použití v klinickej praxi opakovane reprodukovateľný, presný, ľahko interpretovateľný s vysokou senzitivitou a špecificitou.
V našom prípade, predtým, ako sa pustíme do hľadania potenciálneho diagnostického markera, vytvárame proteínový profil, v ktorom by sme chceli poukázať na proteíny, ktoré sú svojím výskytom a expresiou charakteristické pre nami skúmaný model a situáciu, a až tak prípadne zistiť, či sa niektoré z nich neukážu ako potenciálne kardioprotektívne markery. Máme v pláne pozrieť sa cielene aj na niektoré z proteínov, o ktorých predpokladáme, že ich expresia má súvis s endogénnou ochranou, ktorá je kľúčová z hľadiska našich experimentov.

Ďakujem za vecnú odpoveď a držím palce - Váš výskum môže priniesť cenné informácie.
iwa

Dobrý deň, oceňujem zaujímavý príspevok. Chcela by som sa opýtať na limitácie MS v tejto aplikácii a taktiež či si viete predstaviť využitie tejto metodiky v klinickej praxi s ohľadom na intervenciu a riziká pre pacienta?

Pekný deň prajem, ďakujem za otázku. Limitácie využitia MS na identifikáciu potenciálnych markerov, resp. v našom prípade identifikáciu zmien na úrovni proteínov počas sledovaných signálnych dráh kardioprotekcie sa samozrejme nájdu tak ako pri použití akejkoľvek metódy. V našom prípade využívame typ ionizácie - ESI (ionizácia elektrospejom) - tá nie je tolerantná k detergentom a soliam - to znamená, že je náročná na čistotu vzorky, výhodou je, že sa dá ľahko spojiť s HPLC systémom, i keď samotná analýza vyžaduje pomerne dlhý čas chromatografickej separácie... Samozrejme záleží aj od typu analyzátora, ktorý MS využíva. V našom prípade princíp iónovej pasce. Z hľadiska určenia biomarkerov ešte vystupuje jeden problém, nakoľko rovnaké proteíny sú často uvádzané ako biomarkery veľmi odlišných ochorení.
Každopádne MS analýza je určite výhodnou voľbou na určenie a identifikáciu potenciálnych markerov, prípadne určenie zmien na úrovni proteínov a peptidov či už kontrolných, alebo ovplyvnených vzoriek. Výhoda je vysoká variabilita použitého analyzovaného materiálu - od moču, krvi, plazmy, tkaniva, atď... Vždy je však veľmi dôležitá úprava vzorky, a rovnako tak využitie elektroforéznej techniky, predúprava, odsolenie, atď.
V klinike sa metóda MS využíva dosť často, hlavne v oblasti diagnostiky, prípadne pri overení odpovede na terapiu. Z hľadiska srdca sa väčšinou zisťujú ukazovatele ischémie, nekrózy, hemodynamických zmien. Významné sú určite prognostické markery. Určite je z hľadiska MS zaujímavé sledovanie biologicky aktívnych látok, ktorými reaguje srdce na fyziologické a patologické podnety - tieto sú zaujímavé aj pre nás. Samotnou kapitolou je metabolomika, ktorá sa pri využití MS dostáva veľmi do popredia.