Na základe sekvencií moderných enzýmov bol in silico navrhnutý spoločný predok haloalkán dehalogenázy (HLD, EC 3.8.1.5)1 a Renilla luciferín 2-monooxygenázy (RLuc, EC 1.13.12.5)2. Tento ancestrálny proteín nazvaný AncHLD-RLuc vykazuje obe aktivity, dehalogenázovú (10x nižšiu ako HLD LinB) aj luciferázovú (10000x nižšiu ako RLuc).
Porovnanie kryštálových štruktúr ancestrálneho s modernými enzýmami ukázalo ich vysokú štruktúrnu podobnosť. Hlavný rozdiel je vidieť v usporiadaní sekundárnych štruktúr čiapky a v konformácii slučky, ktorá spája hlavnú doménu a čiapku. Flexibilita tohoto regiónu pravdepodobne prispieva k väzbe luciferínu kolentrazínu.
Náhodné inzercie a delécie boli vnesené do AncHLD-RLuc aby sa zistilo, či zmena v kostre proteínu vedie k zmene v jeho aktivite a špecificite. Vytvorené knižnice boli testované na dehalogenázovú a luciferázovú aktivitu a najaktívnejšie hity boli osekvenované a detailne ocharakterizované. Zaujímavé je, že varianty vykazujúce až 60x vyššiu luciferázovú aktivitu niesli zmeny práve v oblastiach, kde sa štruktúra predka najviac odlišuje od enzýmu RLuc.
H2020 Industrial Leadership Project Rafts4Biotech ID 720776.
AncHLD-RLuc
Dobry den, vasa praca je vysoko sofistikova, blahozelam k vysledkom. Zaujimalo by ma ako by ste dokazali spopularizovat a laikom sprostredkovat biologicky vyznam AncHLD-RLuc v zivych systemoch. A este by na zaujimal vas nazor na in silico modelovanie a verifikaciu jeho vysledkov klasickymi "mokrymi" experimentalnymi metodam. Je tam uplna alebo aspon uspokojiva zhoda? Alebo nas dokaze priroda stale prekvapit. :-) Vopred dakujem za odpovede, ZB.
Re: AncHLD-RLuc
Dobry den, dakujem. Vase otazky by vystacili na dlhu diskusiu, ale skusim odpovedat v kratkosti.
U nas v skupine mame tri timy a prave jeden sa zaobera in silico modelovanim a jeden je experimentalny. Je pravda, ze in silico metody nie su 100% uspesne. U nas v laboratoriu sme mali ale mnohe uspechy napr. s racionalnym a semi-racionalnym dizajnom termostabilnych proteinov (bol vyvinuty aj verejne dostupny softver FireProt s jednoduchym uzivatelskym rozhranim). Dokazom uspechu in silico metod je aj konstrukcia spominaneho ancestralneho proteinu AncHLD-RLuc. Tento protein sa v sucasnosti v zivych systemoch nenachadza. U nas v laboratoriu bol zostrojeny prvotne skor z vedeckej zvedavosti ako kvoli konkretnej aplikacii. HLDs maju u nas dlhu tradiciu, a preto bol nas prvy ancestral odvodeny od tejto skupiny enzymov. Odvtedy sa pripravili aj ine ancestralne proteiny z HLD-II rodiny, ktore vykazuju vysoku stabilitu a zaujimavu substratovu specificitu, ktora by sa tazko predpovedala pomocou racionalneho dizajnu. Vo vseobecnosti sa da povedat, ze rekonstrukcia ancestralnych proteinov je dobrym nastrojom na studium strukturno-funkcnych vlastnosti proteinov a samotne ancestralne proteiny su robustnym templatom pre riadenu evoluciu. Ja osobne si myslim, ze zostrojenie multifunkcnych ancestralnych proteinov by mohlo pomoct aj pri snahe o konstrukciu minimalnej bunky.