Charakterizácia modelu replikačnej senescencie In vitro

Charakterizácia modelu replikačnej senescencie In vitro

Celkové hodnotenie

Vedecká práca
100%
Prevedenie (dizajn)
100%
Diskusná interakcia
100%
PoužívateľVedecká prácaDizajnDiskusná interakcia
Ing. Nataša Pavlovičová PhD.100%100%100%
Ing. Dominika Letkovska PhD.100%100%100%
Ing. Tomáš Heizer100%100%100%
Ing Marta Šoltésová Prnová100%100%100%
Mgr. Mária Baňasová PhD.100%100%100%
Ing. Tomáš Kyca100%100%100%
Ing. Zuzana Kočibálová100%100%100%
Ing. Ivana Ševčíková100%100%100%
Ing. Matej Maťaťa PhD.100%100%100%
Ing. Szilvia Kontár100%100%100%
Ing. Lucia Hoppanová100%100%100%
Ing. Zuzana Brnoliaková PhD.100%100%100%
ISBN: 978-80-972360-2-1

Charakterizácia modelu replikačnej senescencie In vitro

Martin Škandík1 , Lucia Račková ,
1 Centrum experimentálnej medicíny, o.z. Ústav experimentálnej farmakológie a toxikológie, SAV, Bratislava, Slovensko
skandik.martin@gmail.com

V dnešnej dobe spoločnosť čelí fenoménu predlžovania dĺžky života, ktorý je spojený najmä s rozvojom modernej spoločnosti, ako aj s pokrokom v liečbe mnohých patológií. Podľa odhadov Svetovej zdravotníckej organizácie v roku 2050 počet ľudí starších ako 60 rokov presiahne 20 % svetovej populácie 1. Na druhej strane starnutie samé o sebe je rizikovým faktorom pre rozvoj ochorení ako sú rakovina, neurodegeneratívne ochorenia a diabetes mellitus. Proces starnutia je spojený s chronickým oxidačným stresom všetkých buniek organizmu. Pretrvávajúce porušenie redoxnej homeostázy má ďalekosiahly vplyv na funkčnosť mitochondrií a lyzozómov, na katabolické, ako aj anabolické procesy či expresiu mnohých génov a stabilitu DNA. V dôsledku týchto faktorov bunka vstupuje do stavu tzv. senescencie, primárne charakterizovanej stratou delenia a rôznymi fenotypickými zmenami, ako jedného zo znakov starnutia. Funkcia a úloha senescentných buniek je stále predmetom výskumu a esenciálnej snahy o porozumenie procesu starnutia. K prioritným cieľom tejto oblasti výskumu patrí objasnenie zmien v redoxnej a proteínovej homeostáze počas starnutia bunky a možností modulácie týchto procesov 2.

Replikačná senescencia ľudských fibroblastov in vitro predstavuje často používaný model starnutia. Je sprevádzaná stratou proliferačnej kapacity, zástavou bunkového cyklu v niektorej z jeho fáz, stratou responsivity na mitogénnu signalizáciu a ďalšími dramatickými zmenami týkajúcimi sa bunkovej morfológie, génovej expresie, epigenetiky a metabolizmu. K hlavným mechanizmom navodzujúcim senescenciu patrí skracovanie telomér, DNA-proteínových komplexov na konci chromozómov 3.

Cieľom našej práce bolo zaviesť a charakterizovať model replikačnej senescencie s použitím primárnych ľudských fibroblastov VH-10. Tento in vitro model má neskôr slúžiť ako vhodný celulárny testovací systém pre štúdium modulácie procesov sprevádzajúcich starnutie pomocou látok prírodného a syntetického pôvodu.

V bunkách neskorých pasáží (105 - 140 DIV) došlo k signifikantnému nárastu markerov senescencie, ako sú aktivita β-galaktozidázy spriahnutej so senescenciou či k nárastu autofluorescencie zodpovedajúcej lyzozomálnej akumulácii lipofuscínu, tzv. „pigmentu starnutia“. Ďalej sme pozorovali zvýšené hladiny intracelulárnych reaktívnych foriem kyslíka v bunkách, čo môže súvisieť so zmenami mitochondriálnej aktivity. Ďalším znakom senescentých buniek je znížená konverzia LC3 proteínu, čo spolu s hromadiacim sa lipofuscínom poukazuje na zhoršenie toku autofágie. V senescentých bunkách došlo k zníženiu proliferačnej kapacity a k blokácii bunkového cyklu v G2/M. Taktiež sme  pozorovali nárast hladín proteínov p53 a p21 v závislosti od dĺžky kultivácie senescentných buniek. Z uvedených výsledkov vyplýva, že daný model poskytuje širokú škálu parametrov spojených s replikačnou senescenciou a  je vhodný pre štúdium mechanizmov starnutia.

Poďakovanie: 

Štúdia bola podporená grantmi: VEGA 2/0041/17, VEGA 2/0029/16, APVV-15-0308, ITMS 26240220040.

Zdroje: 

1. World Health Organization. World Report on Ageing and Health. World Heal. Organ. 1–246 (2015).
2. Höhn, A. et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biol. 11, 482-501 (2017).
3. Victorelli, S. & Passos, J. F. Telomeres and Cell Senescence - Size Matters Not. EBioMedicine 21, 14–20 (2017).

Diskusia

Velmi kvalitna a komplexna praca! Popisujete zavedenie in vitro modelu senescencie, mozete uviest ake ine dalsie taketo modely sa v praxi uz pouzivaju. Ako dalej planujete tento vas model vyuzit: testovanie latok resp. detailnejsie studium molekulovych mechanizmov? Vopred dakujem za odpovede! ZB

Dobrý deň, ďakujem za záujem, ako aj položenú otázku.
V in vitro podmienkach existuje viacero metodických prístupov ako navodiť bunkovú senescenciu, avšak každý z týchto modelov má svoje výhody, ako aj nevýhody. V nami využívanom modeli, kedy v dôsledku dlhodobej kultivácie (spravidla meranej na týždne) dochádza k rozvoju replikačnej senescencie sa môžu využívať najmä primárne bunkové kultúry nie úplne diferencovaných ľudských, prípadne animálnych buniek (najčastejšie fibroblasty a kmeňové bunky). Ľudské bunkové línie na rozdiel od animálnych poskytujú väčšiu génovú stabilitu, zatiaľ čo animálne sú náchylnejšie voči transformácii na rakovinové bunky. Ďalším spôsobom využívaným v in vitro podmienkach je model predčasnej senescencie navodenej v dôsledku stresu (angl. stress induced premature senescence, SIPS), kedy sú bunkové línie vystavené chronickému stresu trvajúcemu pár dní. Týmto spôsobom je možné rozvinúť senescenciu aj u imortalizovaných, prípadne plne diferencovaných nedeliacich sa buniek (napr. neuróny, myocyty v srdci). Stres môže byť vyvolaný rôznymi biochemickými látkami (H2O2, bakteriálne LPS), prípadne fyzikálnymi faktormi (UV, ionizujúce žiarenie). Taktiež je možné využitie starého organizmu na izoláciu buniek a testovanie biochemických prametrov v in vitro podmienkach.
Daný model replikačnej senescencie plánujeme využiť pri sledovaní dlhodobého účinku konjugátu prírodného kvercetínu a syntetického naftochinónu na procesy sprevádzajúce starnutie. Máme v pláne zamerať sa hlavne na popísanie vplyvu prekurzorov a testovanej látky na bunkové prejavy počas starnutia, ako aj ich základné molekulárne mechanizmy, ktoré sú popísané v tejto práci.

Naozaj velmi pekna praca, blahozelam k zaujimavym vysledkom. Zaujimalo by ma ci je vas model standardizovany a ci uz ste ho publikovali v clanku?

Dobrý deň, ďakujem za Váš komentár a otázku.
Ako som už spomínal aj v predchádzajúcej otázke, metodický prístup založený na dlhodobej kultivácii sa všeobecne a veľmi často využíva v experimentálnej praxi. Avšak ľudská diploidná primárna bunková línia VH-10 doposiaľ nebola využitá na tento účel, preto sme rozhodli najprv pre charakterizáciu modelu replikačnej senescencie VH-10. Nadobudnuté výsledky sú zatiaľ prezentované len vo forme konferenčných príspevkov, ale plánujeme ich publikovať aj v časopise.