Peroxidázy sú hémové proteíny katalyzujúce viaceré oxidoredukčné reakcie, napríklad redukciu peroxidu vodíka, či oxidáciu rozličných organických aj anorganických zlúčenín [1]. Peroxidázy nachádzajú uplatnenie v mnohých odvetviach priemyslu, ako sú napríklad elektrochemické biosenzory na báze peroxidáz, kde v spojení s enzýmom produkujúcim peroxid vodíka je možno detekovať rozličné látky [2-3], či odstraňovaním syntetických farbív oxidatívnym poškodením farebných zlúčenín [4].
Branchiostoma belcheri je kopijovec obsahujúci tyroidnú peroxidázu so sekvenciou, ktorá vykazuje homológiu s ľudskou [5] a má potenciál byť vhodným enzýmom pre biotechnologické aplikácie. Cieľom tejto práce bola optimalizácia produkcie tyroidnej peroxidázy z Branchiostoma belcheri v Escherichia coli z hľadiska výťažku, a zároveň čo najvyššieho podielu solubilného rekombinantného proteínu.
V práci sme testovali viacero kmeňov E. coli, ktoré boli transformované plazmidom obsahujúcim syntetický gén pre peroxidázu s optimalizovanými kodónmi pre E. coli. Bunky sme kultivovali v troch typoch média a pri troch rôznych teplotách kultivácie pre optimalizáciu produkcie enzýmu. Expresia proteínu bola dosiahnutá u všetkých kmeňov pri dvoch teplotách a dvoch typoch média. Avšak majoritný podiel proteínu bol produkovaný insolubilný, vo forme tzv. inklúznych teliesok. Preto budú nutné ďalšie experimenty s použitím postupov, pri ktorých je možno dosiahnuť solubilný enzým.
Príspevok je výsledkom realizácie projektu Agentúry na podporu výskumu a vývoja (APVV-14-0375) a tiež vďaka podpore projektov: „Univerzitný vedecký park Univerzity Komenského v Bratislave - 2. Fáza“ (ITMS 2014+ 313021D075) a „Rozvoj centra excelentnosti pre využitie informácií o biomakromolekulách pri ochoreniach a prevencii a v zlepšení kvality života“ (BIOMAKRO2 - ITMS 26240120027), financovaných zo zdrojov ERDF.
[1] Hamid M., Khalil-ur-Rehman. (2009) Food Chemistry. 115, p. 1177-1186.
[2] Jia J., Wong B., Wu A., et al. (2002) Anal. Chem. 74, p. 2217-2223.
[3] Ruzgas T., Csoregi E., Katakis I., et al. (1996) J. Mol. Recognit. 9, p. 480-484.
[4] Shin K S, Kim C J (1998) Biotechnol. Lett. 20, 569-572.
[5] Ogasawara M. (2000) Dev. Genes. Evol. 210, p. 231-242.
Vhodny hostitel?
Dobry den, mna by zaujimalo, ci si myslite, ze dovodom vzniku inkluznych teliesok moze byt to, ze nejde o bakterialny enzym a vy sa ho snazite exprimovat v E. coli? Mohla by peroxidaza z B. belcheri na spravne "zbalenie" potrebovat specialne chaperony, ktore v E. coli nie su? Pripadne, myslite, ze by mohlo pomoct, keby sa nechal nasyntetizovat gen pre peroxidazu z B. belcheri s optimalizaciou kodonov pre expresiu v E. coli? Dakujem.
Re: Vhodny hostitel?
Dobrý deň. Za vznikom inklúznych teliesok môže byť rad dôvodov, fakt že ide o enzým z vyššieho organizmu nevynímajúc. Čo sa týka chaperónov, možnosť tam je tiež, pričom riešením (resp. ďalšou optimalizáciou) by mohla byť práve koexpresia so chaperónom. Ohľadom optimalizácie kodónov génu peroxidázy pre E. coli - to je uvedené v treťom odstavci abstraktu, pracovali sme s génom, ktorý už mal optimalizované kodóny.
ďalšie detaily, kvantifikácia uvedených údajov
Dobrý deň, zaujal ma Váš príspevok. V abstrakte spomínate homológiu TPO z kopijovca s ľudskou, je možné vyčísliť tento údaj, napr. v percentách? Z akých iných druhov je možné získať TPO homologickú s ľudskou, tiež prípadne vyčíslite v percentach jej stupen. Ďalej by ma zaujímali biotechnologické aplikácie TPO, môžete ich konkretizovať? Cielom Vasej prace bolo optimalizovat produkciu TPO, tiež by ma zaujímalo ci sa toto da nejako kvantifikovat co sa tyka vytazku, prípadne ake boli Vase zistenia. Vopred ďakujem za komentáre, ZB