Neuraminidases are hydrolytic enzymes acting on glycosidic linkage of terminal sialic acids in glycoproteins, glycolipids, oligosaccharides, colominic acids and synthetic substrates [1]. Function of these enzymes is essential in pathogenesis of many viral and bacterial infections [2]. Discovery of potent neuraminidase inhibitors, as well as development of high-throughput methods for their activity evaluation is therefore desirable in treatment and prophylaxis of these diseases [3 - 4]. In our work, we have developed a method for evaluation of neuraminidase activity and its inhibitors. In the developed lectin-based method, the lectin Peanut agglutinin (PNA) was used for the determination of galactose moiety exposed after cleavage of sialic acid from immobilized fetuin by neuraminidase from Clostridium perfringens. Described method was performed in microtiter-plates with quantification of desialylation by fluorescent dye. Our next aim is miniaturization of this method to microarray format.
This work was supported by the SRDA grants APVV-14-0294, APVV-15-0111, APVV-16-0088 and VEGA 2/0137/18.
[1] KANEHISA, M. et al. KEGG: New perspectives on genomes, pathways, diseases and drugs. In Nucleic Acids Research. 2017. Vol. 45, no. D1, s. D353–D361.
[2] CORFIELD, T. Bacterial sialidases - roles in pathogenicity and nutrition. In Glycobiology. 1992. Vol. 2, no. 6, s. 509–521.
[3] KASHIF, M. et al. Recent developments in trans-sialidase inhibitors of Trypanosoma cruzi. In Journal of Drug Targeting. 2017. Vol. 25, no. 6, s. 485–498.
[4] SCHWERDTFEGER, S.M. et al. Sialidases in biological systems. In Pharmazie. 2010. Vol. 65, no. 8, s. 551–561.
Graf 1C
Dobry den, mohla by ste obsirnejsie popisat informacie ktore su demonstrovane v grafe 1C?
Dakujem, s pozdravom, P. Farkas
Korelacia
Dobry den, mna by zaujimalo, ci sa hodnota IC50 pre a-mangostin, ktoru ste namerali vasou metodou, zhoduje s hodnotou nameranou sucasne pouzivanymi metodami? Dakujem.
Sample preparation
Dobry den, kedze vasa praca si kladie za ciel vyvoj miniaturizovanej bioanalytickej metódy, zaujimalo by ma na aky typ biologickej vzorky by ste ju pouzili a ako odhadujete jej diagnosticky potencial smerom k viralnym a bakterialnym infekciam. Ake minimalne mnozstvo biologickej vzorky by vstupovalo do analyzy, odhadom ako casovo a financne narocna by bola samotna preparacia vzorky pred kvantifikaciou na mikrotitracnej dosticke? ZB
Re: Sample preparation
Dobry den, mne po prvom precitani prispevku napadla rovnaka otazka. Ked som si prezentaciu presla este raz, tak som nadobudla pocit, ze nepojde o analyzu biologickych vzoriek, ale o testovanie potencialnych (prirodnych/syntetickych?) inhibitorov neuraminidazy ako antiviralnych lieciv. Mozno by to autorka mohla objasnit. Dakujem.
Odpoveď autora
Dobrý deň, ďakujem za otázky.
V grafe 1C je zobrazený vplyv nedostatočného vymytia reakčných roztokov na priebeh nasledujúcej reakcie/reakcií. V prípade BSA nedochádza k zásadnej zmene signálu, ale vymytie blokovacieho roztoku z jamiek zvyšuje presnosť (STDEV 5,6% bez vymytia klesne na 2,1% a menej po vymytí aspoň 2x). Nedostatočné vymytie fluorescenčnej značky umelo zvyšuje meraný signál (bol sledovaný približne 20%-ný pokles signálu pri porovnaní jamiek, ktoré vymyté neboli a tých, ktoré sa premyli 3x) a po troch premytiach je rozdiel signálu (po premytí 3x a 4x) nižší, než STDEV. Pri lektínoch sa signál už po druhom premytí signifikantne nemení. Pokles RFU oproti nepremytým jamkám sa dá vysvetliť interakciou biotínu nenaviazaného lektínu a streptavidínu konjugovaného s fluorescenčnou značkou v roztoku a jeho vymytím po inkubácii s ňou.
Čo sa týka IC50, to by sa medzi rôznymi metódami nemalo porovnávať. Pri takto postavenej metóde však nie je možné získať Ki a kinetické parametre. Takže pri tejto metóde inhibítory možno porovnávať len na základe IC50 v rámci tej istej metódy. Mangostin bol zatiaľ testovaný ako jediný, preto je to len “proof of concept”.
Výhody metódy sú: možnosť použiť prírodné substráty, ktoré sú imobilizované (čo napodobňuje podmienky v hostiteľskom organizme), zníženie vplyvu interferencií premývaním jamiek (pre enzýmovú reakciu a tiež pred meraním), avšak trvanie analýzy je veľká nevýhoda oproti tým, ktoré sú bežne používané teraz (hlavne v porovnaní s umelými substrátmi). Preto je cieľom miniaturizovať metódu do formátu microarray, ktorá si zachová výhody, síce aj trvanie analýzy, ale umožňuje testovanie veľkého počtu inhibítorov (a ich porovnanie medzi sebou) pri veľmi nízkej spotrebe reagentov. Tu už namiesto 96-jamiek v jednej platničke je možná analýza až približne 2 tisíc spotov na jednom sklíčku. Objem roztokov aplikovaných moderným bezkontaktným spotterom na jeden spot sa pohybuje medzi 1,5 – 2 nL. Počet spotov a objemy aplikovaných roztokov však závisia od konkrétneho prístroja. Pre takéto množstvo vzoriek už ale trvanie analýzy nepredstavuje takú nevýhodu.
Z finančného hľadiska je metóda v mikroplatničnke porovnateľná s používanými umelými substrátmi a časovo náročnejšia (imobilizovaný glykoproteín je stabilný v chladnicke po dobu asi 2 týždňov, takže platničku možno pripraviť dopredu, analýza od blokovania jamiek s BSA po meranie fluorescencie trvá približne 4 hodiny). Miniaturizovaná by už ale poskytla výhodu z finančného hľadiska (malé množstvá reagentov, v prípade, že je už k dispozícii spottovacie zariadenie a čítačka) a pravdepodobne aj z časového (keďže jedna analýza (s jedným sklíčkom) zodpovedá približne 20-tim mikroplatničkám)
Pre vývoj liečiv by táto metóda ponúkla možnosť screeningu veľkého počtu potenciálnych inhibítorov naraz, ale je mierená k čistým enzýmom a nie biologickým vzorkám. Z tohto súboru inhibítorov by bolo možné vybrať niekoľko „hit“-ov a tie testovať na typ inhibície. Pre liečivá tohto typu sa hľadajú hlavne kompetitívne inhibítory. Test na odlíšenie inhibície pomocou tejto metódy zatiaľ nebol uskutočnený a v tomto momente nevieme experimentálne potvrdiť, či bude fungovať (experimenty sú ale už naplánované). V súčasnosti sú komerčne dostupné (aj keď drahé) knižnice látok s predpokladaným biologickým účinkom, tieto by na testovanie boli ideálne. Veľké množstvo údajov (hlavne ak bude možné odlíšiť typ inhibície) by sa mohlo použiť ako vstup pre techniky molekulového modelovania, ktoré poskytujú možnosť identifikovať farmakofóry vhodné pre daný enzým a cielený dizajn ďalších inhibítorov.