Účinky plazmou aktivovaného média na zdravé a rakovinové bunky

Účinky plazmou aktivovaného média na zdravé a rakovinové bunky

Celkové hodnotenie

Vedecká práca
87%
Prevedenie (dizajn)
93%
Diskusná interakcia
93%
PoužívateľVedecká prácaDizajnDiskusná interakcia
Dávid Kubek100%100%100%
Ing. Zuzana Brnoliaková PhD.60%80%80%
Mgr. Pavol Valovič100%100%100%
ISBN: 978-80-972360-2-1

Účinky plazmou aktivovaného média na zdravé a rakovinové bunky

Dominika Mihaliková1 , Dominika Sersenová , Helena Gbelcová 2 , Vanda Repiská , Zdenko Machala ,
1 Fakulta matematiky, fyziky a informatiky, Univerzita Komenského, Bratislava, Slovensko
2 Lekárska fakulta, Univerzita Komenského, Bratislava, Slovensko
dominika.mihalik@gmail.com

Rakovina je ochorenie, pri ktorom dochádza k transformácii normálnej, zdravej kmeňovej bunky na atypickú alebo dysplastickú. V Slovenskej republike sú nádorové ochorenia druhou najčastejšou príčinou úmrtia. V súčasnej dobe sa toto ochorenie lieči excíziou nádoru, rádioterapiou alebo chemoterapiou. Všetky tieto postupy so sebou prinášajú rôzne vedľajšie účinky, preto je snaha nájsť alternatívne prístupy liečby a minimalizovať vedľajšie účinky.   

V posledných rokoch došlo k výraznému rozvoju plazmovej medicíny, ktorá sa zaoberá rôznymi aplikáciami plazmy v medicíne a biológii. Plazma je navonok neutrálny, ionizovaný plyn, ktorý obsahuje elektróny, ióny, neutrálne častice a atómy, ako aj reaktívne častice. Tieto reaktívne častice majú dokázateľné antimikrobiálne účinky, ktoré viedli k testovaniu účinkov plazmy na rakovinové bunky ako potencionálnej alternatívy pre liečbu nádorového ochorenia. 

Cieľom našej práce bolo experimentálne otestovať účinky plazmou aktivovaného tekutého kultivačného média (plasma activated medium, PAM) na bunky. Použili sme bunkové línie A375 (ľudské epitelové bunky melanómu) a HEK293T (ľudské embryonálne bunky obličky transformované adenovírusom). V experimente sme bunky nasádzali na 96 jamkové platničky. V každej jamke sa nachádzalo približne 2x104 buniek. Celkovo sme mali 4 platničky – 2 s A375 a 2 s HEK293T. Kultivačné médium DMEM (Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium) sme opracovávali dvomi typmi plazmového výboja v atmosférickom vzduchu – korónovým (SC) a iskrovým (TS) – v dobe trvania 0,5 min/ml a 2 min/ml. Do každej jamky sme napipetovali 200 μl PAM, 2 h po opracovaní média. Účinky PAM na bunky sme testovali pomocou metabolického MTT testu. Merali sme absorbanciu vzorky v každej jamke, z ktorej sme následne vypočítali viabilitu buniek. Merania sme uskutočnili 24 h a 72 h po aplikácii PAM na bunky. Porovnávali sme viabilitu buniek v PAM s viabilitou pozitívnej kontroly, teda buniek v neopracovanom médiu. V prípade zdravých buniek HEK293T sme po 24 h pozorovali zníženie viability úmerné intenzite a dobe opracovania, ale po 72 h došlo k nárastu viability na pôvodné hodnoty. V prípade rakovinových buniek A375 sme po 24 h taktiež pozorovali zníženie viability, ale po 72 h sa viabilita buniek už nezmenila. Na štatistické vyhodnotenie sme použili parametrický test – jednofaktorová ANOVA s viacnásobnými porovnaniami. Rozdiely viability medzi kontrolou a opracovanými bunkami pre HEK293T po 24 h boli štatisticky významné (p<0,05) pre všetky typy opracovania, po 72 h boli signifikantné rozdiely pri opracovaní SC 0,5 min/ml, TS 0,5 min/ml a TS 2 min/ml, kde sme pozorovali letálne účinky na zdravé bunky. V prípade A375 sme pozorovali signifikantné rozdiely (p<0,05) viability pri opracovaní TS 0,5 min/ml a TS 2 min/ml po 24 h ako aj po 72 h. 

Naše výsledky indikujú potenciál využitia plazmy ako alternatívy na liečbu rakoviny, je však potrebné vykonať ďalšie experimenty, ktoré by tieto účinky potvrdili.       

Poďakovanie: 
Zdroje: 

FRIDMAN, Alexander, FRIEDMAN, Gary. Plasma Medicine. 2013. ISBN 9780470689707. DOI: 10.1002/9781118437704
IDIKIO, Halliday A. Human cancer classification: A systems biology-based model integrating morphology, cancer stem cells, proteomics, and genomics. In: Journal of Cancer. 2011, roč. 2, č. 1, s. 107-115. ISSN 18379664. DOI: 10.7150/jca.2.107
MARTIŠOVITŠ, Viktor. Základy fyziky plazmy. Bratislava: Univerzita Komenského Bratislava, 2006. ISBN 80-223-1983-X.
Úrad verejného zdravotníctva Slovenskej Republiky. Správa o zdravotnom stave obyvateľstva Slovenskej republiky za roky 2012 – 2014. Bratislava, 2015. Získané z http://www.uvzsr.sk/docs/info/podpora/Sprava_o_zdravotnom_stave_obyvatelstva_SR_za_roky_2012_2014.pdf
 

Diskusia

Dobry den, velmi potrebny vyskum! Zaujimalo by ma, ci aj plazmova medicina ma nejake vedlajsie ucinky. Mohli by ste komplexne zhodnotit jej konkurecnu vyhodu voci klasickej radioterapii a chemoterapii. Co je limitujucim faktorom jej dalsieho pouzitia: cenova dostupnost? pristrojove vybavenie? malo poznatkov? Mate vedomost o tom, ci sa tieto poznatky uz vyuzivaju aj v klinickom vyskume, alebo je to zatial len otazka zakladneho vyskumu a teda studuje sa to len na urovni in vitro? Ako odhadujte, ze sme daleko od pouzitia plazmovej mediciny v praxi? Vopred dakujem za odpovede, ZB

Dobrý deň, zatiaľ neboli pozorované závažné vedľajšie účinky, ale samozrejme by bolo potrebné vykonať v tejto oblasti ďalšie experimenty, v ľudskom tele môže plazma pôsobiť inak ako na bunky in vitro. Predpokladá sa, že vedľajšie účinky by mali byť minimálne oproti vedľajším účinkom terajších terapeutických metód a pacientom by sa zvýšila kvalita života počas prebiehajúcej liečby. In vivo testy už boli vykonané niekoľkými vedeckými tímami (Francúzsko, Nemecko) na animálnych modeloch (xenotransplantácia ľudkých nádorových buniek). Výsledky vyzerajú celkom sľubne, ale ešte určite pár rokov potrvá kým dôjde ku klinickým testom, netrúfam si odhadnúť dobu. Čo sa týka limitácii, určite je ešte priestor na vylepšenie. Napríklad zdroj plazmy, ktorý sme využivali my v našom experimente by nebol vhodný na klinické testy, ale existujú plazmové perá a trysky, ktoré by sa v tejto oblasti dali využiť. Plazma by bola vhodná predovšetkým na liečbu kožných nádorov, keďže by bolo problematické priamo ju aplikovať na vnútorné orgány.

Dobrý deň Dominika, teší ma, že sa zapájajú aj "služobne mladšie ročníky" a to prácami s veľmi slušnou úrovňou. Vzhľadom na to, že ide o základný výskum alternatívnych možností v terapii onkologických ochorení, ktorý sa testuje zatiaľ len na bunkových kultúrach, je veľmi predčasné porovnávať tento prístup so štandardne používanými modalitami. Predovšetkým treba overiť spoľahlivosť účinku pri vymedzenej "dávke" (ktorú predstavuje celé experimentálne nastavenie). Overovanie v zmysle letálneho účinku, ktorý spomínate v prezentácii, sa robí viacerými metódami (testami). Vy ste pracovali s testom metabolickej aktivity. Aký iný test by bol vhodný ako doplnkový na testovanie viability? Možno by bolo vhodné testovať dvoma testami v súlade s cieľmi - zámerom je usmrtiť nádorové bunky, ale paralelný cieľ je nepoškodiť zdravé tkanivo za hranicu, za ktorou by sa už nebolo schopné regenerovať. Neuvažovali ste v tíme o takejto možnosti? Ďakujem.
iwa

Dobrý deň, ďakujem veľmi pekne za otázky. Samozrejme existuje veľa rozličných metód na overovanie viability, vo veľa prípadoch sa využíva práve MTT test, ktorý sme použili aj v našom experimente. V literatúre, ktorú som čítala na hodnotenie viability použili aj farbenie trypánovou modrou, toto farbivo sa považuje karcinogén a môže dôjsť k usmrteniu buniek, ktoré opracovanie plazmou prvotne prežilia tým k falošnému výsledku. Na zisťovanie viability sa využíva aj FDA (fluoresceín diacetát) v kombinácii s PI (propium jodid). Určite by bolo zaujímavé použiť dva testy, to by však bolo pri našom dizajne náročné. My sme pracovali so štyrmi 96-jamkovými platničkami a opracovanie média bolo časovo náročné, pri použití viacerých testov by sa tento čas ešte zvýšil, pretože by sme potrebovali ďalšie platničky. Možno, ak by sme médium nemuseli prenášať z FMFI na LF by to bolo zvládnuteľné. Je v pláne postaviť prenosný zdroj, ktorý by bolo možné preniesť na LF a pridať médium na bunky priamo po opracovaní plazmou. V tom prípade by sa dalo opracovať väčší objem média a teda použiť aj viac testov.