Príprava rekombinantného plazmidu s inzertom šaperón-like génu z Cronobacter sakazakii pod indukovateľným lac wt promótorom

Príprava rekombinantného plazmidu s inzertom šaperón-like génu z Cronobacter sakazakii pod indukovateľným lac wt promótorom

Celkové hodnotenie

Vedecká práca
100%
Prevedenie (dizajn)
100%
Diskusná interakcia
PoužívateľVedecká prácaDizajnDiskusná interakcia
RNDr. Romana Záhumenská PhD.100%100%-
Mgr. Eva Struhárňanská100%100%-
Bc. Kristína Macáková100%100%-
ISBN: 978-80-972360-2-1

Príprava rekombinantného plazmidu s inzertom šaperón-like génu z Cronobacter sakazakii pod indukovateľným lac wt promótorom

Linda Mihálová1 , Eva Struhárňanská , Monika Chovanová , Zdenko Levarski2 , Martin Šafranek , Stanislava Bírová , Silvia Rybecká , Stanislav Stuchlík , Ján Turňa ,
1 Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Bratislava 4, Slovenská republika
2 Univerzita Komenského v Bratislave, Vedecký park, Ilkovičova 8, 84215 Bratislava 4, Slovenská republika
lindamihalova@gmail.com

Molekulárne šaperóny predstavujú špecializované proteíny, ktoré participujú pri správnom skladaní novovznikajúcich polypeptidov  („de novo folding“), v „refoldingu“ denaturovaných proteínov, a taktiež v ich proteolytickej degradácii [1]. Zistilo sa, že kmene rodu Cronobacter vlastnia genomický ostrov termotolerancie s veľkosťou 15kbp, v ktorom sa identifikovali viaceré gény stresovej odpovede, vrátane šaperón-like sekvencií, ako napr. gén orfD [2]. Pri heterológnej expresii rekombinantných proteínov vo vyššej koncentrácii býva jedným z negatívnych javov tvorba agregátov, tzv. inklúznych teliesok. Renaturácia takýchto agregátov prebieha v bunke E. coli s nízkou frekvenciou, v dôsledku čoho vzniká biologicky neaktívny proteín [3].

Hlavným cieľom našej práce je konštrukcia rekombinantného plazmidu s inzertom génu orfD pod indukovateľným lac wt promótorom.

V našej práci sme úspešne amplifikovali DNA fragmenty s orfD a orfC+D sekvenciami z kmeňa C. sakazakii LMG 5740 pomocou gradientovej PCR. V získaných transformantoch po ligácii vektora s oboma DNA sekvenciami sme pri skríningu zatiaľ nepotvrdili konštrukciu plánovaných rekombinantných plazmidov. V ďalšej práci budeme pokračovať v skríningu rekombinantného plazmidu s vloženým génom orfD, resp. orfC+D, kódujúcim šaperón pod kontrolou indukovateľného lac promótora. Následne využijeme konštrukty pri funkčných štúdiách.

Poďakovanie: 

Táto publikácia vznikla vďaka podpore projektov: „Univerzitný vedecký park Univerzity Komenského v Bratislave – 2. Fáza“ (ITMS 2014+ 313021D075), „Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov“ (BIOREKPROT – ITMS: 26240220048) a „Rozvoj centra excelentnosti pre využitie informačných biomakromolekúl na zlepšenie kvality života“ (BIOMAKRO2 - ITMS 26240120027), financovaných zo zdrojov ERDF, financovaných zo zdrojov ERDF.

Zdroje: 

[1] Hartl F. U. (1996) Nature 381, p. 571.
[2] Orieskova M., Kajsik M., Szemes T. et al. (2016) Antonie van Leeuwenhoek 109: p. 405.
[3] Ellis R. J., Minton A. P. (2006) Biol. Chem. 387, p. 48.

Diskusia

Dobry den, chcem sa opytat, preco ste si vybrali ako ciel genovy produkt orfD z kmena C. sakazakii? Podla toho, co pisete v uvode, nie je zatial potvrdene, ze sa jedna o saperon z rodiny ClpB. Ked sa vam podari pripravit rekombinantny vektor, na expresiu ktorych proteinov ho chcete vyskusat? Myslite si, ze by mohol byt ucinnejsi ako ClpB napr. z E. coli? Dakujem.

Dobrý deň,

1. Kmeň C. sakazakii a orfD gén sme si zvolili na základe výsledkov predchádzajúcich štúdií rodu Cronobacter prebiehajúcich na našej katedre. Daný kmeň preukázal významnú termotoleranciu a vlastní genomický ostrov termotolerancie. Na základe porovnania sekvencií ostrova s DNA databankou známych sekvencií sa preukázalo, že niektoré oblasti vykazujú šaperónovú povahu. Nakoľko sa naša katedra zaoberá aj heterologickou expresiou a jej optimalizáciou, zvolili sme si orfD z daného ostrova. Daná vlastnosť nie je potvrdená, preto si ju našim experimentom chceme overiť.
2. Výber proteínov bude nastavený podľa ich dostupnosti na našom pracovisku, momentálne sa pozornosť venuje príprave konštruktu.
3. Našim cieľom zatiaľ nie je porovnávať účinnosť génového produktu ClpB z E.coli a iných bakteriálnych kmeňov. Chceme overiť jeho funkciu a následne ho aplikovať v heterologickej expresii.