Baktéria s najrýchlejším životným cyklom- Vibrio natriegens ako potenciálny kmeň pre heterologickú expresiu

Baktéria s najrýchlejším životným cyklom- Vibrio natriegens ako potenciálny kmeň pre heterologickú expresiu

Celkové hodnotenie

Vedecká práca
85%
Prevedenie (dizajn)
90%
Diskusná interakcia
100%
PoužívateľVedecká prácaDizajnDiskusná interakcia
Bc Miroslava Mališová60%80%-
Mgr. Eva Struhárňanská100%100%-
Linda Mihálová100%100%-
Ing. Zuzana Brnoliaková PhD.80%80%100%
ISBN: 978-80-972360-2-1

Baktéria s najrýchlejším životným cyklom- Vibrio natriegens ako potenciálny kmeň pre heterologickú expresiu

Kristína Macáková1 , Silvia Rybecká , Monika Chovanová , Eva Struhárňanská , Zdenko Levarski2 , Júlia Šarkanová , Stanislav Stuchlík ,
1 Univerzita Komenského v Bratislave, Katedra molekulárnej biológie,Ilkovičova 6, 84215, Bratislava 4, Slovensko
2 Univerzita Komenského v Bratislave, Vedecký park ,Ilkovičova 8, 84215, Bratislava 4, Slovensko
kikusamacakova@gmail.com

Vibrio natriegens je gram negatívna, nepatogénna baktéria, ktorá bola vyizolovaná z brakických močiarov . V. natriegens je charakteristické svojím rýchlym životným cyklom, pretože jeho „ doublingtime“ je < 10 min a teda  dvakrát rýchlejší ako u biotechnologicky široko využívanej Escherichia coli [1]. Medzi jeho ďalšie pozitívne vlastnosti patrí vysoký obsah ribozomálnej DNA[2]. Vďaka týmto vlastnostiam bolo V. Natriegens vybrané na štúdium ako nový, expresný a efektívny systém, ktorý by mohol vo farmaceutickom a biotechnologickom priemysle zefektívniť produkciu rekombinantných proteínov. Jeho použite by významne znížilo časové nároky rozsiahleho spektra experimentov, pretože až 90% času experimentu je viazaný na rast kultúry.                                                                                                                          

Základným cieľom tejto práce bola optimalizácia transformácie divého kmeňa V. natriegens, rôznymi typmi klonovacích a expresných plazmidov pomocou elektroporácie podľa Weinstocka [3]. V pilotných experimentoch sme sa pokúšali transformovať V. natriegens wt pomocou plazmidov, ktoré niesli rezistenciu na antiobiotikum kanamycín a ampicilín. Pri týchto experimentoch sme zistili, že V. natriegens wt je prirodzene rezistentné na vysoké koncentrácie kanamycínu. Transformácia sa však podarila. Prekážky, ktoré bude treba prekonať v ďalších experimentoch sú aj stabilita/ segregácia plazmidovej DNA v populácii v pripravených transformantov. Predmetom optimalizácie taktiež budú parametre ako dĺžka regenerácie buniek po elektroporácii, koncentrácia antibiotík pri selekcie transformantov, teplota kultivácie a zvolené napätie pri elektrickom výboji pri elektroporácii .

Baktéria V. natriegens wt však stále predstavuje zaujímavú alternatívu ku expresnému systému založenému na E. Coli, a to i z hľadiska ekonomického benefitu. Na základe výsledkov z pilotných experimentov sa v ďalšej práci zameriame hlavne na genetické úpravy V. natriegens wt pomocou systému CRISPR/ Cas9.

Poďakovanie: 

Poďakovanie- Táto práca vznikla vďaka podpore z projektu: „ Univerzitný vedecký park Univerzity Komenského v Bratislave- 2. Fáza“ ( ITMS 2014 + 31302D075) a tiež projektu „Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov“ ( BIOREKPROT – ITMS 2624022048), financovaných zo zdrojov ERDF. S. R. bola tiež podporená grantom Nadácie EPH.

Zdroje: 

[1] Eagon, R.G. (1962) JB 83 p. 737.
[2] Aiyar, Sarah E., Gaal T., GourseR.L. (2002) JB 184, p. 1349.
[3] Weinstock M.T., Hesek E., Hesek, D. a kol. (2016) Nature Methods 13, p.849.

Diskusia

Dobry den, chcem sa opytat, ci ste vedeli, ze V. natriegens su uz komercne dostupne na trhu od SGI-DNA a su optimalizovane na expresiu proteinov? Maju knock-out extracelularnej nukleazy a inzerciu IPTG-indukovatelnej T7 RNA pol. kazety. Ake geneticke upravy planujete vy?
Dakujem.

Vieme o komerčnom kmeni Vmax a aj sa ním zaoberáme v laboratóriu a snažíme sa optimalizovať efektivitu transformácie a otestovať vplyv na solubilitu proteínu v porovnaní s E. coli.
Zaujímavý je pre nás aj divý kmeň kvôli tomu, že by sme si mohli nadstaviť vlastnú sadu úprav, deletovať viaceré nukleázy, prípadne pokúsiť sa vniesť do V. natriegens glykozylačný systém, a taktiež nemusíme byť odkázaný iba na T7 expresný systém ako u komerčného kmeňa, ktorý je optimalizovaný priamo na tento typ expresie.

Dobry den, zaujal ma udaj rychlosti zivotneho cyklu u V. natriegens, ktory je udajne <10 min. Ake faktory ovplyvnuju tento udaj, co je tu najviac limitujuce a co myslite, preco je "doubling time" u E. coli 2x pomalsi? Aka je konkretna hodnota rychlosti ziv. cyklu u E. coli? Su zname tieto udaje aj o inych druhoch bakterii, mozete ich uviest, pre zaujimavost, aspon pat, prosim vas? Dakujem! ZB

Dobrý deň, medzi faktory, ktoré ovplyvňujú doublingtime u V. natriegens je zvýšený počet ribozómov. Taký počet ribozómov môže byť výsledkom, že V. natriegens je mierny halofil a je izolovaný z brakických vôd a predpokladá sa, že tento rozdiel je výsledkom evolúcie v adaptácii na pôvodne prirodzené prostredie . Konkrétna hodnota životného cyklu/ čas delenia pri 37 stupňoch E. coli je 31,3 min a V. natriegens je 14,8 min. Takéto hodnoty sú známe aje pre iné druhy baktérií, napríklad: Streptococcus lactis - 26 min, Staphylococcus aureus - 27-30 min Mycobacterium tuberculosis - 792-932 min , Treponema pallidum . 1980 min , Lactobacillus acidophilus - 66-87 min ( časy sú udávané pri optimálnych podmienkach ). Ďakujem . KM