Myrozinázy (β-tioglukozid glukohydrolázy) sú súčasťou dômyselného obranného systému rastlín a slúžia na aktiváciu glukozinolátov, sekundárnych metabolitov, ktoré samotné majú iba obmedzenú biologickú aktivitu. V prípade mechanického porušenia rastlinných pletív dochádza ku kontaktu myrozinázy s glukozinolátmi a k hydrolytickému štiepeniu ich tioglykozidovej väzby. Okrem D-glukózy vzniká aj nestabilný aglykón, ktorý sa spontánne rozkladá na rôzne druhy produktov, akými sú napríklad tiokyanáty, izotiokyanáty alebo nitrily. Tvorba týchto produktov je závislá od viacerých faktorov, ako je druh substrátu, pH alebo dostupnosť iónov železa [1]. Už dávnejšie sa zistilo, že degradačné produkty glukozinolátov chránia rastliny pred účinkom hmyzu a fytopatogénov [2], v súčasnom období priťahujú pozornosť najmä vďaka ich schopnosti potláčať vznik a rozvoj rakoviny [3] a ich využiteľnosti v chemickej syntéze pri výrobe ušľachtilých zlúčenín [4]. Prevažne z týchto dôvodov sa myrozinázy intenzívne študujú a zároveň sa hľadajú nové alternatívne zdroje týchto enzýmov, ktoré by sa vyznačovali zaujímavými molekulovými vlastnosťami. Najbohatším zdrojom sú rastliny z čeľade kapustovitých, prevažne v zrelých semenách, napríklad v brokolici (Brassica oleracea var. Italica), kapuste obyčajnej (Brassica oleracea), repke olejnej (Brassica napus) alebo horčici žltej (Brassica juncea). Samotná myrozináza nie je výlučne exprimovaná len v rastlinách, objavená bola aj v mnohých mikroorganizmoch. Typickým príkladom sú vláknité huby z rodu Aspergillus spp. a Fusarium spp. [5]. Hoci prítomnosť myrozináz(y) v rode Trichoderma nebola nikdy preukázaná, jej prítomnosť v hube indikuje samotný fakt, že členovia tohto rodu dokážu existovať v symbióze s rastlinami [6] a spomedzi pôdnych eukaryotických mikroorganizmov patria k tým, ktoré sú relatívne odolné voči účinku izotiokyanátov [7].
Hlavným cieľom tejto práce je preskúmať schopnosť druhov z rodu Trichoderma tvoriť myrozinázy počas ich rastu a diferenciácie vyvolanej svetlom. Súčasťou štúdie je charakterizácia vlastností fungálnych myrozináz na základe pozorovania vplyvu fyziologicky účinných látok na enzýmovú aktivitu týchto enzýmov.
Táto práca vznikla s podporou projektu APVV-16-0439.
[1] Bones, A. M. a kol.: The myrosinase-glucosinolate system, its organization and biochemistry. Physiol. Plant 97, 194–208 (1996). [2] Rask, L. a kol.: Myrosinase: gene family evolution and herbivore defense in Braddicaceae. Plant Molecular Biology 42, 93–113 (2000). [3] Huang, M. T. a kol.: Cancer chemoprevention by phytochemicals in fruits and vegetables. Food Phytochemicals for Cancer Prevention I (ACS Symposium Series) 1, 2–16 (1994). [4] Gueyrard, D. a kol.: Reactivity of a chiral 1, 3-oxazolidine-2-thione obtained from vegetable source through chemo-enzymatic processing. Heterocycles 52, 827–634 (2000). [5] Smits, J. P. a kol.: Glucosinolate degradation by Aspergillus clavatus and Fusarium oxysporum in liquid and solid-state fermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 38, 696–701 (1992). [6] Zeilinger, S. a kol.: Friends or foes? Emerging insights from fungal interactions with plants. FEMS Microbiol. Rev. 40, 182–207 (2016). [7] Smith, J. a Kirkegaard, J. A.: In vitro inhibition of soil microorganisms by 2-phenylethyl isothiocyanatePlant Pathology 51, 585–593 (2002).
Cistota a aktivita enzymu
Dobry den, chcela by som sa opytat, ako boli ziskane enzymy na meranie myrozinazovej aktivity? Enzymovu aktivitu mate v grafe vztiahnutu na mg proteinu, ale v metodike prace purifikaciu neuvadzate. Dakujem.
Re: Cistota a aktivita enzymu
Dobrý deň, ďakujem Vám za otázku. Áno máte pravdu purifikačné kroky nie sú uvedené s toho dôvodu, že tieto experimenty sú predbežne vykonané na hrubých homogenátoch. Samotnú purifikáciu máme momentálne rozpracovanú.
vytaznost myrozinaz
Dobry den, zaujimalo by ma, ak sa to vobec da vycislit, aka je produkcna sila vlaknitych hub rodu Trichoderma vzhladom na ziskavanie myrozinaz pre ucely dalsich experimentov. Dakujem, ZB
Re: vytaznost myrozinaz
Dobrý deň, ďakujem za opýtanie. Na základe doterajších experimentov nie je možné určiť produkčnú silu Trichoderma vzhľadom na myrozinázy. Na základe enzýmovej aktivity to nie je možné zhodnotiť, pretože všetky experimenty boli vykonané na hrubých homogenátoch a hydrolýza môže byť katalyzovaná aj inými glykozidázami. Avšak hodnoty špecifických aktivít Trichoderma a špecifických aktivít typických rastlinných producentov myrozináz z čeľade kapustovité (kapusta, brokolica alebo repka) sú porovnateľné. S toho dôvodu predpokladáme ich prítomnosť, ale celkovú produkčnú sila budeme vedieť až po získaní výsledkov po ukončení purifikácie enzýmu.
glykozidázy
Zaujímavá téma, dúfam že bude mať pokračovanie. Trošku si dajte pozor na terminplógiu - nemerali ste glukozidázové, ale glykozidázové aktivity.
Sú na trhu čisté B-glukozidázy z Trichodermy? Možno by stálo za úvahu pozrieť sa na ich aktivitu voči sinigrínu a z toho odhadnúť, či pozorovaná myrozináza nie je len prípad šišej substátovej špecificity B-glukozidázy.
Re: glykozidázy
Dobrý deň, ďakujem Vám za upozornenie ohľadom terminológie. V budúcnosti sa podobným nepresnostiam budem snažiť vyvarovať.
Momentálne nemám žiadnu vedomosť o tom, že by existovali na trhu čisté B-glukozidázy purifikované z Trichoderma. Existujú však preparáty, ktoré obsahujú lytické enzýmy z Trichoderma (napr. Trichoderma harzianum). Konkrétny preparát máme k dispozícii a uvažovali sme už nad jeho experimentálnom otestovaní. Rovnako si kladieme túto otázku, či namerané údaje sú naozaj konkrétne myrozináza alebo ako ste naznačili je to len širšia substrátová špecifickosť.
Daná téma má pokračovanie, momentálne pracujeme na optimalizácii purifikácie a identifikácie prostredníctvom hmotnostnej spektrometrie.