Candida utilis bola schválená ako GRAS mikroorganizmus (všeobecne uznávaný ako bezpečný) od F.D.A. (Úrad pre potraviny a liečivá) a jej výhodnou vlastnosťou je, že jej sekretóm neobsahuje proteolytické enzýmy, ktoré sú v médiu nežiadúce z dôvodu náročnejšej purifikácii a možnej degradácii produktu. Na riadenie expresie heterológnych proteínov v expresnom systéme Candida utilis, je možné využiť konštitutívny promótor glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy GAP, pretože neinhibuje rast a nie je toxický pre bunky. Enterokináza je serínová proteáza a je ideálnym nástrojom na štiepenie rekombinantne produkovaných fúznych proteínov, pretože po štiepení N-terminálneho peptidu v sekvencii (Asp)4Lys, nezanecháva na rekombinantnom proteíne aminokyselinové zvyšky. Cieľom práce bolo optimalizovať využitie kodónov v sekvencii enterokinázy pre kvasinku C. utilis a následne pripraviť konštrukt pGAP-EKop vložením génu kódujúceho enterokinázu bez rozpoznávacích sekvencií pre proteázy Kex2 a Ste13.
Táto práca bola pripravená na základe podpory APVV-0119-12 a vďaka podpore v rámci operačného programu Výskum a inovácie pre projekt: Univerzitný vedecký park Univerzity Komenského v Bratislave – 2. Fáza, ITMS 2014+ 313021D075, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja. A príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov” (BIOREKPROT – ITMS: 26240220048), projekt: „Rozvoj centra excelentnosti pre využitie informačných biomakromolekúl na zlepšenie kvality života“ (BIOMAKRO2 - ITMS 26240120027), financovaných zo zdrojov ERDF, projekt „Priemyselný výskum nových liečiv na báze rekombinantných proteínov“ (Rekprotein - ITMS: 26240220034), financovaných zo zdrojov ERDF.
[1] Domínguez A., Fermiñán E., Sánchez N., et al. (1998) Int. Microbiol. 1(2), p. 131.
[2] Buerth C., Heilmann J. C., Klis F. M., et al. (2011) Microbiol. 157, p. 2493.
[3] Lu D., Futterer K., Korolev S., et al. (1999) J. Mol. Biol. 292(2), p. 29.
[4] Huang L., Ruan H., Gu W., et al. (2007) Prep. Biochem. Biotecjnol. 37(3), p.205.
konštrukt pGAP-EKop
Dobry den, zaujimala by ma dalsia etapa vasho vyskumu, co sa bude dalej diat s výsledným konštruktom pGAP-EKop, ake dalsie experimenty s nim planujete, ako hlbsie sa da tato tematika rozvijat? Vopred dakujem za odpovede, ZB
Re: konštrukt pGAP-EKop
Dobry den, nasledujucim krokom bude klonovanie tohto plazmidu kvasinkovými bunkami C. utilis. Po uspesnej transformacii bude nasledovat vyber vhodných klonov na expresiu. Nasledne tieto klony otestujeme banickovou expresiou a vyberieme najvodnejsieho kandidata na expresiu enterokinazy v maloobjemovom fermentore. Nikola Mojtova
Spolupráca
Dobrý deň, pekná práca - zaujíma ma, či na tejto problematike spolupracujete s nejakým zahraničným tímom, keďže sa rekombinantné kmene C.u. (a iných mikroorganizmov) čoraz viac začínajú študovať pre reálnu možnosť ich využitia v autoimunitnej terapii. Je váš výskum aj súčasťou nejakého medzinárodného projektu? Ďakujem.
iwa
Re: Spolupráca
Re: Re: Spolupráca
Ďakujem za odpoveď a budem držať palce :)
iwa
Re: Spolupráca
Ďakujem :)
Nikola Mojtová
Re: Spolupráca
Dobrý deň, bohužiaľ nespolupracujeme zatiaľ s nikým iným ale snažíme sa vytvoriť expresný systém založený na C. utilis a dúfame, že by sa nám mohli v budúcnosti otvoriť dvere aj do zahraničia a tak spolupracovat aj so zahraničným tímom. Nikola Mojtová