Katalázy-peroxidázy sú bifunkčné enzýmy, ktoré patria do triedy I rastlinnej, fungálnej a bakteriálnej nadčeľade peroxidáz. Hlavnou úlohou týchto hémových proteínov je rozklad peroxidu vodíka na kyslík a vodu. Termostabilná AfKatG kataláza-peroxidáza z Archaeoglobus fulgidus bola prvýkrát charakterizovaná v roku 2001. Tento enzým je homodimér s molekulovou hmotnosťou podjednotky 85 kDa [1].

Cieľom našej práce bola expresia mutantnej termostabilnej katalázy-peroxidázy AfKatG v E. coli BL21 a posúdenie jej solubility, termostability a aktivity. Termostabilné enzýmy majú široké využitie v mnohých priemyselných odvetviach a ich purifikácia je značne zjednodušená oproti klasickým enzýmom.

Po transformácií E. coli plazmidmi pJexpress404AfKatGMut1 a pJexpress404AfKatGMut2 obsahujúcich mutovanú katalázu-peroxidázu prebehla úspešná expresia indukovaná IPTG. Tieto plazmidy obsahovali rozdielne bodové mutácie, ktoré mali odstrániť katalázovú aktivitu a zvýšiť peroxidázovú aktivitu. V kmeni BL21 s plazmidom pJexpress404AfKatGMut1 tvorila kataláza-peroxidáza 25,29 % z celkového množstva produkovaných proteínov a v kmeni BL21 s plazmidom pJexpress404AfKatGMut2 tvorila kataláza-peroxidáza 27,7 % z celkového množstva produkovaných proteínov. Uchované sedimenty z expresie sme homogenizovali a solubilnú frakciu podrobili čiastočnej purrifikácii zahrievaním na 70 °C, čím sme dosiahli stupeň prečistenia 2,65 (AfKatGMut1) a 2,8 (AfKatGMut2). Pomocou SDS-PAGE elektroforézy sme zistili, že produkovaná AfKatG kataláza-peroxidáza bola čiastočne solubilná a termostabilná v oboch prípadoch. Na záver sme merali kinetiku reakcie peroxidázovej aktivity. Katalázová aktivita bola podľa očakávania nulová kvôli zavedeniu bodovej mutácie. Peroxidázová aktivita dosahovala niekoľko jednotiek na mg proteínu, čo je však aktivita porovnateľná s nemutovaným enzýmom.

Expresiou AfKatG katalázy-peroxidázy v E. coli kmeni BL21 sme produkovali solubilný a termostabilný enzým, avšak zavedené bodové mutácie nezvýšili peroxidázovú aktivitu. Zavedením iných, nových mutácií, využitím nových prístupov, alebo úplným zmenením peroxidázy, by sme mohli získať peroxidázu s požadovanou aktivitou, ktorá by sa dala využiť v mnohých biotechnologickým aplikáciách, ako napríklad oxidácia aromatických zlúčenín.