Včasná detekcia patogénov nachádzajúcich sa v potravinách je dôležitá pre zabezpečenie potravinovej bezpečnosti. Komerčné metódy využívané v súčasnosti sú zdĺhavé. Potvrdenie negatívnej vzorky trvá 72 hodín a až týždeň pre potvrdenie pozitívnej vzorky. Okrem typických metód využívajúcich kultiváciu živých buniek schopných tvorbe kolónií, sa využívajú aj metódy real-time PCR (polymerase chain reaction), ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) alebo ELFA (Enzyme-Linked Flurescent Assay). Ich nevýhodou však sú vysoké opakujúce sa náklady a taktiež v prípade PCR aj fakt, že podáva informácie aj o usmrtených bunkách. Práve preto je nutné vyvinúť technológiu, ktorá bude lacná, rýchla, jednoduchá a dostatočne presná. Biosenzory v kombinácií s aptamérmi ponúkajú takéto možnosti.
Práca je zameraná na vývoj a testovanie biosenzora na báze DNA aptamérov na detekciu patogénnych baktérií Listeria innocua pomocou metódy kryštalických mikrováh (QCM - quartz crystal microbalance). Aptasenzor bol vytvorený na povrchu piezokryštálu, ktorý po aplikovaní vysokofrekvenčného napätia začína kmitať v strižnom móde s určitou frekvenciou. Zmena hmotnosti citlivej vrstvy vedie k zmene frekvencie, čo umožňuje detekciu interakcií na povrchu piezokryštálu. Pre detekciu Listeria innocua bol použitý aptamér špecifický pre rod Listeria spp, do ktorého spadá 16 poddruhov, z toho 3 sú vylúčené, nakoľko ich štruktúra antigénov sa odlišuje od ostatných druhov (L. murrayi, L. grayi, L.ivanovii).
Zistili sme, že pri interakcií buniek Listeria innocua s aptamérom špecifickým pre Listeria spp. došlo k zníženiu rezonančnej frekvencie. Taktiež sme zistili, že aptamér je preukázateľne špecifický pre Listeria innocua, nakoľko nereagoval na prítomnosť baktérie E. coli, s ktorou majú Listeria spp. totožné niektoré parciálne antigény a tým spôsobujú skrížené reakcie v sérologických testoch. Pripravený aptasenzor preukázal dobrú citlivosť a špecifickosť k detekcií Listeria innocua v reálnom čase, s časom detekcie 30 min. Limit detekcie bol približne 1.6 x 103 CFU/ml.
Táto práca bola financovaná Európskou úniou v rámci programu Horizont 2020, Marie Skłodowska-Curie, kontrakt číslo 690898 a bola taktiež podporená vedeckou grantovou agentúrou VEGA, číslo projektu: 1/0419/20.
Biotín
Je to zaujímavá práca, chcela by som sa opýtať aká je úloha biotínu vo vašich meraniach?
Neutravidín
Pekná práca, chcela by som sa opýtať prečo ste povrch kryštálu modifikovali neutravidínom?
Re: Neutravidín
Ospravedlňujem sa, ale omylom som to komentovala bez prihlásenia a viacnásobne, takže moja odpoveď je: Ďakujem za otázku, povrch kryštálu je nutné modifikovať neutravidínom, nakoľko neutravidín interaguje s biotinizovaným aptamérom (jeden koniec modifikovaný Biotínom) tvorbou silnej, stabilnej väzby. Neutravidín je derivát, ktorý je možné priamou chemisorpciou naviazať na zlato.
Aplikácia potravinovej vzorky
Gratulujem k veľmi peknému príspevku Veronika. Chcem sa spýtať, v akej podobe by bola aplikovaná potravinová vzorka? Je potrebná nejaká úprava? Je predpoklad, že by sa citlivosť biosenzora mala zachovať? Alebo by sa líšila v porovnaní s výsledkami modelových experimentov?
Prajem veľa úspechov v práci.
iwa
Re: Aplikácia potravinovej vzorky
Ďakujem veľmi pekne pani doc. Konkrétne na detekciu L. monocytogenes je málo štúdií, avšak v jednej uviedli, že bola možná detekcia 10e2 CFU/ml v mlieku použitím senzora na báze piezoelektrickej kantilevery a protilátok (avšak u nich bolo nutné zosilnenie signálu až terciárnym naviazaním protilátok). Teda na základe tejto štúdie predpokladám, že áno malo by to byť možné, avšak si myslím že bude nutné minimálne riedenie, nakoľko môže dôjsť k vytrhávaniu vrstvy aptaméra. Citlivosť by sa mohla zachovať za predpokladu, že baktérie nevytvoria agregáty s rôznymi súčasťami mlieka.
Ďakujem za otázku.
Re: Re: Aplikácia potravinovej vzorky
Ďakujem Veronika a prajem veľa úspešných experimentov.
iwa
Re: Re: Re: Aplikácia potravinovej vzorky
Ďakujem pani docentka, nápodobne Vám prajem veľa úspechov.
Re: Re: Biotín
Ospravedlňujem sa, ale omylom som komentovala bez prihlásenia.
Zmena frekvencie
Pekná a zaujímavá práca. Chcel by som sa spýtať na Obr.5, ako si vysvetľujete výraznú zmenu frekvencie z 5x10e5 CFU na 10e6 CFU? Prípadne, prečo medzi týmito dvoma bodmi nebolo použitý PBS roztok?
Re: Zmena frekvencie
Ďakujem za otázku. Po aplikovaní vyššej koncentrácie bakteriálnej vzorky sa vytrhávala vrstva aptaméru, preto sme zaznamenali nárast frekvencie. Jednalo sa o anomáliu, ktorú sme nepredpokladali. Keďže došlo k návratu na pôvodnú hodnotu, bolo potrebné ihneď otestovať, či po zvýšení koncentrácie frekvencia aj naďalej porastie. Softvér SARKu taktiež nie je vhodný na príliš dlhé merania, takže sme koncentráciu otestovali okamžite po aplikácií predchádzajúcej vzorky. V budúcnosti sa plánujeme tomuto javu venovať bližšie a zamerať sa aj na tieto vyššie koncentrácie. Pre nás ale boli momentálne kľúčové nižšie koncentrácie.