Genetická nestabilita v subpopuláciách hematopoetických kmeňových a progenitorových buniek pupočníkovej krvi detských pacientov s akútnou lymfoblastovou leukémiou

Genetická nestabilita v subpopuláciách hematopoetických kmeňových a progenitorových buniek pupočníkovej krvi detských pacientov s akútnou lymfoblastovou leukémiou

Celkové hodnotenie

Vedecká práca
100%
Prevedenie (dizajn)
100%
Diskusná interakcia
100%
PoužívateľVedecká prácaDizajnDiskusná interakcia
Mgr. Alena Líšková100%100%-
Mgr. Lenka Koklesová100%100%-
Mgr. Terézia Valkovičová100%100%100%
Bc. Katarína Vigašová100%100%-
Bc. Dominika Kochanová100%100%100%
MUDr. Mgr. Vladimír Šišovský PhD.100%100%100%
ISBN: 978-80-972360-6-9

Genetická nestabilita v subpopuláciách hematopoetických kmeňových a progenitorových buniek pupočníkovej krvi detských pacientov s akútnou lymfoblastovou leukémiou

Katarína Bérešová1 , Lukáš Jakl , Pavol Košík , Matúš Durdík , Jana Jakubíková , Marek Holop2 , Miroslav Kubeš , Eva Marková , Igor Belyaev ,
1 Ústav experimentálnej onkológie, BMC SAV, Bratislava, Slovensko
2 Eurocord-Slovakia, Bratislava, Slovenská republika
katberes@gmail.com

Všeobecne akceptovanou teóriou vzniku akútnej lymfoblastovej leukémie (ALL), najčastejšej formy leukémií u detí, je model dvoch zásahov do DNA. Prvý zásah je často reprezentovaný chromozomálnou translokáciou v hematopoetických kmeňových a progenitorových bunkách (HSPC) a ich premenou na preleukemické kmeňové bunky. Výsledkom translokácie je vznik preleukemického fúzneho génu (PFG), môže brániť správnej diferenciácií krvných buniek. K tomuto procesu dochádza už v intrauterinnom vývine dieťaťa, pričom tento nie je dostatočný na vznik leukémie. K úplnej leukemickej transformácií dochádza vplyvom sekundárnych bodových mutácií až v postnatálnom období. V súčasnosti nie je známe, ktoré štádium vývoja HSPC je zodpovedné za vznik leukémie. V našom laboratóriu sme preto urobili jedinečnú spätnú analýzu vzácnych vzoriek zamrazenej pupočníkovej krvi detských pacientov s ALL. Pozreli sme sa na ich krv odobratú v čase narodenia, kedy boli ešte zdraví a snažili sa identifikovať subpopuláciu preleukemických kmeňových buniek zodpovedných za neskorší vznik leukémie.

Izolované mononukleárne bunky jednotlivých pupočníkov boli metódou FACS (fluorescence activated cell sorting) na základe kombinácie 6 CD markerov (CD45RA, CD45, CD34, CD38, CD90, CD19) na ich povrchu rozdelené na 8 subpopulácií, od najkmeňovejších buniek až po diferencované lymfocyty. Z dôvodu vzácnosti jednotlivých subpopulácií boli tieto následne expandované na mezenchymálnych kmeňových bunkách po dobu približne 11 dní. Prítomnosť PFG v jednotlivých subpopuláciách bola analyzovaná priamo metódou Fluorescenčnej in situ hybridizácie (FISH), ktorá s použitím špeciálnych dual-fusionbreak-apart fluorescenčných prób zabezpečuje takmer stopercentnú špecificitu. Použitie daných prób nám zároveň umožnilo okrem samotných translokácií sledovať aj duplikácie a delécie skúmaných génov. Detegovali sme najčastejšie typy PFG, vyskytujúcich sa pri diagnostike ALL (TEL/AML1, BCR/ABL, prestavby MLL), v pupočníkovej krvi 4 pacientov (2 s TEL/AML1 v čase diagnózy, 1 so ziskom TEL, AML1 a ABL v čase diagnózy, 1 bez translokácie) a 4 kontrolných probandov v celkovej vzorke MNC a 8 triedených subpopuláciach. Pri negatívnych probandoch sme pozorovali minimálnu pozitivitu (2/65 vzoriek) na úrovni 0,125% a 1,5% aberantných buniek z celkového množstva analyzovaných. U pacientov bolo celkovo pozitívnych až 49/71 vzoriek, pozitivita dosahovala úroveň až 31%.

Chromozomálne translokácie a iné aberácie sa vyskytovali v takmer každej subpopulácií HSPC pacientov v závislosti od pacienta a typu použitej próby. Z doterajších výsledkov nie je možné určiť, či je pre neskorší vznik ALL potrebné zasiahnutie konkrétnej subpopulácie HSPC. Naše výsledky ale potvrdzujú prenatálny vznik leukémie a zároveň po prvýkrát ukazujú na vysoké percento genetickej nestability najčastejších PFG (TEL/AML1, BCR/ABL, MLL prestavby) v subpopuláciách  HSPC už v embryonálnom vývine pacientov s ALL. 

Poďakovanie: 

Tento projekt bol podporený Agentúrou na podporu výskumu a vývoja (APVV-15-0250).

Zdroje: 

Diskusia

Zdravím. Chcela by som sa spýtať dve otázky.
1. Z výsledkov jasne vidno duplikácie ako píšete vo výsledkoch. Z čoho je však možné vyčítať delécie?
2, Ak total % znamená celkové množstvo aberantných buniek, môže byť toto percento nižšie ako percento gain of AML buniek v Sp3?
Ďakujem vopred za odpovede

Zdravím, ďakujem za otázky a prikladám odpovede.
1. Delécie sa pri použití dual-fusion próby veľmi ťažko hodnotia, pretože prítomnosť len jedného signálu nemusí znamenať deléciu jeho homologického partnera, jeden väčší signál môže indikovať ich vzájomné prekrytie (pričom sa môžu nachádzať v rôznych rovinách). Delécie sú spoľahlivo detegovateľné pri break-apart type próby (fialová kolónka), na grafe ich však slabo vidno, lebo ich hodnota bola na minimálnej úrovni.
2. Áno percento celkových prestávb môže byť nižšie ako percento jednotlivých prestávb, a to preto, lebo ide o priemernú hodnotu všetkých prestávb u všetkých probandov. Priemer hodnôt TEL/AML1 translokácií, TEL + AML1 duplikácií, TEL duplikácií a AML1 duplikácií (teda 0, 0.1 , 0.15, 0.45) v tomto prípade tvorí hodnotu 0.35.