jazyk / language:
INTERAKTÍVNA KONFERENCIA
MLADÝCH VEDCOV
Späť do sekcie

Využitie cre-loxP systému v plazmidových vektoroch pre inzerciu ľahkého reťazca ľudskej enterokinázy do membrány Golgiho aparátu kvasinky Candida utilis

Diskusná interakcia
Celkové prevedenie (dizajn)
Vedecká práca
Zobraziť všetky hodnotenia

Prejsť do diskusie

Využitie cre-loxP systému v plazmidových vektoroch pre inzerciu ľahkého reťazca ľudskej enterokinázy do membrány Golgiho aparátu kvasinky Candida utilis

Lea Lukáčová 1 Adriána Dusíková 1 Terézia Czödörová 1 Tomáš Németh 1 Johana Dlapová 1 Kristína Hriňová 1 Ján Krahulec 1

1Prírodovedecká fakulta Univerzity Komenského, Bratislava, Slovenská republika
lea.lukacova1@gmail.com

Kvasinka Candida utilis predstavuje bežnú industriálnu kvasinku s klasifikáciou GRAS (Generally recognised as safe). Za bežných okolností nám v laboratóriu kvasinka poskytuje široké spektrum výhod. Ide predovšetkým o jej rast na lacných substrátoch, pričom je schopná rýchlej adaptácie na rôzne zdroje uhlíka a dusíka [1 – 2]. S rozvojom nových poznatkov o expresných vektoroch a heterologických systémoch sa využitie C. utilis rozšírilo aj o produkciu heterologických produktov, akými sú napríklad sladký monellin, α-amyláza a xylóza. Vymenované vlastnosti nám poukazujú na jej účinnosť a porovnateľnosť s inými kvasinkovými druhmi, ako sú napríklad Sacharomyces cerevisiae [3].

Cieľom našej práce je zameranie sa na výrobu plazmidu pGE123 pre ukotvenie ľahkého reťazca ľudskej enterokinázy do lumenu Golgiho aparátu. Výber ľudskej enterokinázy pre našu prácu súvisí s negatívnymi vlastnosťami niektorých proteáz, ktoré často zanechávajú nadbytočné aminokyseliny po štiepení na N-konci cieľového proteínu, čo môže spôsobovať problémy pri ďalších posttranslačných úpravách [1 – 3]. S využitím klonovania sa nám podarilo vniesť do plazmidu pGE123 zeocínovú kazetu ohraničenú loxP miestami. Skonštruovaný plazmid pGE123 má integratívny charakter a pre jeho integráciu do chromozómu využívame homologickú rekombináciu v oblasti 18S rDNA. Integráciou plazmidu, budeme môcť sledovať expresiu enterokinázy do kultivačného média. Enzým ApaLI štiepil pGE122 v dvoch miestach zeocínovej rezistencie a plazmid si tak spätne nezískal zeocínovú rezistenciu.

V ďalšej práci budeme konštruovať plazmid pME122, ktorého sekvencie sú zhodné s plazmidom pGE123. Výraznú odlišnosť predstavuje len promótorová sekvencia PGAP, ktorá je v prípade plazmidu pME122 nahradená PGLC (maltózou inducibilným promótorom). Spomínaný promótor bude vymieňaný za mutované formy so zníženou katabolickou represiou ale so zachovanou citlivosťou pre maltózu ako prirodzený induktor. Dôvodom výmeny za mutované formy je najmä silná expresia z promótora PGAP, ktorého expresiu nevieme regulovať ako pri promótore PGLC.

Kľúčové slová: Candida utilis, enterokináza, heterológne proteíny

Tento projekt bol pripravený na základe projektu „Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov“ (BIOREKPROT - ITMS: 26240220048) financovaný zo zdrojov ERDF a vďaka projektom APVV-17-0149 a PP-COVID-20-0019.
[1] Buerth, C., Heilmann, C., Klis, F. M., et al. (2011). Growth-dependent secretome of Candida utilis. Microbiology, 157(9), p. 2493-2503. DOI: https://doi.org/10.1099/mic.0.049320-0.
[2] Ergün, B. G., Hüccetoğullar, S., Öztürk, S., et al. (2019). Established and Upcoming Yeast Expression Systems. In: Gasser, B., Mattanovich, D. (ed.) Recombinant Protein Production in Yeast. Methods in Molecular Biology, Humana Press, New York, USA, p. 1
[3] Kunigo, M., Buerth, C., Tielker, D., et al. (2013). Heterologous protein secretion by Candida utilis. Applied Microbiology and Biotechnology, 97(16), p. 7357-7368. DOI: https://doi.org/10.1007/s00253-013-4890-1.
Zdá sa, že Váš internetový prehliadač nepodporuje prehliadanie PDF dokumentov.
Pre zobrazenie súboru je potrebné maš nainštalovaný Adobe Reader.

Diskusia

Diskusia je zatiaľ prázdna, buďte prvý komentujúci
Naši partneri
Generálny partner

Partneri
Špeciálne poďakovanie
Mediálni partneri
Inzercia zadarmo
Usporiadateľ