jazyk / language:
INTERAKTÍVNA KONFERENCIA
MLADÝCH VEDCOV
Späť do sekcie

Porovnanie frakcionačných techník pri analýze fosfoproteómu kvasinky Schizosaccharomyces pombe


Prejsť do diskusie

Porovnanie frakcionačných techník pri analýze fosfoproteómu kvasinky Schizosaccharomyces pombe

Barbara Siváková 1 Veronika Lukáčová 2 Ján Jurčík 3 Tomáš Selický 3 Ingrid Čipáková 3 Ľuboš Čipák 3 Peter Baráth 1,2

1Chemický ústav, SAV, Bratislava, SK
2Medirex Group Academy, n.o., Trnava, SK
3Biomedicínske centrum, SAV, Bratislava, SK
chembsiv@savba.sk

Fosforylácia je postranslačná modifikácia modulujúca funkciu proteínu, ktorá je nevyhnutná pre bunkovú signalizáciu, proliferáciu, diferenciáciu a rast. Ide o dynamický proces, ktorého deregulácia spôsobuje množstvo chorobných procesov, vrátane rakoviny (1). Technológie založené na kvapalinovej chromatografii, ktorá je spojená s hmotnostnou spektrometriou (MS) predstavujú efektívny nástroj na identifikáciu proteínov a ich postranslačných modifikácií. Pretože fosforylované  peptidy sa nachádzajú v komplexných vzorkách v oveľa menšom zastúpení, v porovnaní s ich nemodifikovanými formami, je nutné, aby pracovný postup obsahoval krok zabezpečujúci obohatenie fosforylovaných peptidov (2). Nevyhnutnou prípravy vzoriek je aj frakcionácia, ktorá významne znižuje komplexnosť vzoriek a tým zvyšuje množstvo identifikovaných fosforylačných miest. 

Nedávno optimalizovaný pracovný postup z nášho laboratória zahŕňa extrakciu proteínov, enzymatické štiepenie proteínov na peptidy a extrakciu na reverznej fáze. Nasledujú kroky typické pre prípravu fosfoproteomických vzoriek, konkrétne obohatenie fosfopeptidov pomocou afinitnej chromatografie s imobilizovaným kovom (IMAC) a frakcionácia pomocou silnej anión-výmennej (SAX) a poréznej grafitovej (PGC) chromatografie. Na MS analýzu sa používa kvapalinová chromatografia nanoflow Ultimate HPLC spojená s hmotnostným spektrometrom Orbitrap. Na spracovanie a bioinformatickú analýzu MS dát sa využívajú softvérové ​​nástroje MaxQuant a Perseus (3).

Takýmto spôsobom boli analyzované dve skupiny vzoriek, ktoré sa líšili použitou frakcionačnou technikou, PGC resp. SAX. Rozdiely medzi vzorkami boli skúmané na úrovní proteínových skupín, ako aj fosforylačných miest. Z našich zistení vyplýva, že pomocou rôznych techník sú vzorky obohacované o rozličné fosfopeptidy. Preto kombináciou rôznych frakcionačných metód je možné dosiahnuť významné zvýšenie množstva identifikovaných fosforylačných miest. Použitím vyššie uvedeného spôsobu prípravy vzoriek a následnej analýzy pomocou hmotnostnej spektrometrie sme  boli schopní identifikovať 1274 nových, doposiaľ neanotovaných fosforylačných miest, ktoré môžu byť prínosné pre pochopenie regulácie bunkových procesov.

Táto práca vznikla vďaka podpore Agentúry na podporu výskumu a vývoja, v rámci projektu č. APVV-16-0120, VEGA grantov 2/0026/18 a 2/0039/19, a Slovenskej akadémie vied, v rámci programu pre doktorandov č. APP0007. Na podpore projektu sa ďalej podieľal Operačný program Integrovaná infraštruktúra pre projekt: Centrum pre biomedicínsky výskum – BIOMEDIRES – II. etapa, kód ITMS: 313011W428, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.
  1. (1) Zhang, J., Yang, P.L., and Gray, N.S. (2009). Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nat. Rev. Cancer 9, 28–39.
    (2) Ruprecht, B.; Koch, H.; Medard, G.; Mundt, M.; Kuster, B.; Lemeer, S. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Mol. Cell. Prot. 2015, 14, 205–215.
    (3) Sivakova, B., Jurcik, J., Lukacova, V., Selicky, T., Cipakova, I., Barath, P., & Cipak, L. (2021). Label-Free Quantitative Phosphoproteomics of the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe Using Strong Anion Exchange-and Porous Graphitic Carbon-Based Fractionation Strategies. International journal of molecular sciences22(4), 1747.
Zdá sa, že Váš internetový prehliadač nepodporuje prehliadanie PDF dokumentov.
Pre zobrazenie súboru je potrebné maš nainštalovaný Adobe Reader.

Diskusia

Pavol Farkaš Farkaš
Administrátor
replikat vs. vzorka 12.05.2021 12:59
Dobry den Dr. Sivakova,

chcel by som poprosit, viete upresnit nasledovne: ...biologické replikáty pripravené rovnakou frakcionačnou
technikou korelovali významnejšie, ako vzorky prip...
Zobraziť celý komentár
Re: replikat vs. vzorka 13.05.2021 07:36
Dobrý deň dr. Farkaš,
mieru korelácie možno odčítať z bodového grafu. Ak si napr. vyberieme biologický replikát S1 vzorky pripravenej PGC a SAX, hodnota sa rovná 0,711. No ak si porovnáme...
Zobraziť celý komentár
Pavol Farkaš Farkaš
Administrátor
Re: Re: replikat vs. vzorka 13.05.2021 21:02
Dakujem za odpoved a zelam vela zdaru! :-)
Tereza Golias
Moderátor
IP-vzorky 13.05.2021 19:30
Dobry den,
ako clovek neznaly techniky by som sa chcela opytat, ze keby som potrebovala identifikovat fosfo-miesta na proteine, ktory v malom mnozstve vytiahnem z nadorovych buniek imunoprecipitaciou, ...
Zobraziť celý komentár
Re: IP-vzorky 17.05.2021 08:25
Dobrý deň,
myslím si, že áno, aj keď v takomto prípade by som asi volila iný spôsob obohatenia, napr. na malých kolónkach s oxidom titaničitým. Ďakujem
Siváková
Tereza Golias
Moderátor
Re: Re: IP-vzorky 17.05.2021 10:43
Dakujem za velmi pekne za odpoved. :)
Naši partneri
Generálny partner

Partneri
Špeciálne poďakovanie
Mediálni partneri
Inzercia zadarmo
Usporiadateľ