Využitie hmotnostnej spektrometrie v proteomickej analýze vzorky srdca po 1D gélovej elektroforéze

Cieľom práce je poskytnúť základné informácie o možnostiach využitia hmotnostnej spektrometrie (MS) v proteomickej analýze vzorky srdca. Proteomické prístupy sa v súčasnosti ukazujú byť ako jedným z dôležitých nástrojov pre hľadanie nových potenciálnych proteínových a peptidových markerov.

Pre samotnú prípravu vzorky sme použili metódu štiepenia proteínov na kratšie peptidové úseky. Po elektroforetickej separácii v 10% polyakrylamidovom géli boli proteíny vyrezané z gélu ako tzv. spoty o veľkosti 2x2 mm (výrez zodpovedá molekulovej hmotnosti 35-50 kDa) a následne podrobené enzymatickému štiepeniu. Pre zisk kvalitného fondu peptidov sme rozrušili terciárnu a kvartérnu štruktúru proteínov redukciou disulfidových väzieb a tým zabránili ich reoxidácii procesom alkylácie. Na redukčné štiepenie sa použil roztok DTT (c = 10 mmol/l), následná alkylácia bola prevedená roztokom iodoacetamidu (c = 55 mmol/l). Najčastejšie používaným enzýmom na štiepenie proteínu na peptidy je pre jeho dobrú použiteľnosť a vysokú špecificitu trypsín. K vysušeným spotom sa pridal roztok trypsínu (c = 0,02 mg/ml).  Vzorka bola následne podrobená MS analýzou s využitím iónového zdroja ESI. Samotný princíp metódy MS spočíva v meraní pomeru hmotnosti m a náboja z analyzovanej látky. Po nástreku vzorky dochádza k ionizácii, pričom molekula dostáva náboj. Následne dochádza k separácii nabitých častíc v analyzátore podľa ich pomeru m/z. Častice nakoniec dopadajú na detektor. Výsledkom je hmotnostné spektrum (závislosť intenzity na m/z). Pre uchovanie relevantných proteomických údajov a korelačnú analýzu sme využili softvérovú platformu Proteinscape. Ako vyhľadávací nástroj pre identifikáciu proteínov bol použitý Mascot server.

V pilotnej štúdii sme analyzovali vzorky z cytozolovej frakcie izolované z ľavej komory srdca potkanov kmeňa Wistar. Zvolenou metodikou sme identifikovali 8 proteínov v spote. Jednotlivé analýzy prebiehali duplicitne. Na overenie získaných výsledkov budú v rámci opakovania experimentov jednotlivé vzorky hodnotené triplicitne - v sérii 3 nezávislých meraní.

Proteomické analýzy v oblasti kardioprotekcie sa ukazujú byť perspektívnou voľbou pre identifikáciu proteínov ako potenciálnych kardiomarkerov. Nemenej významným uplatnením je ich využitie pri vytváraní proteínových máp pri charakterizovaní rozdielov v podmienkach fyziologických a patologických stavov.