Výskum kompenzačných mechanizmov srdca na úrovni mitochondrií pomocouhmotnostnej spektrometrie a fluorescenčnej spektroskopie

Výskum kompenzačných mechanizmov srdca na úrovni mitochondrií pomocouhmotnostnej spektrometrie a fluorescenčnej spektroskopie

Celkové hodnotenie

Vedecká práca
90%
Prevedenie (dizajn)
80%
Diskusná interakcia
80%
PoužívateľVedecká prácaDizajnDiskusná interakcia
RNDr. Miroslav Horváth PhD.100%100%-
Ing. Zuzana Brnoliaková PhD.80%60%80%
ISBN: 978-80-972360-4-5

Výskum kompenzačných mechanizmov srdca na úrovni mitochondrií pomocouhmotnostnej spektrometrie a fluorescenčnej spektroskopie

Pavol Mišenko1 , Iveta Waczulíková , Miroslav Ferko2 , Natália Andelová , Šimon Šutý ,
1 Katedra jadrovej fyziky a biofyziky, Fakulta matematiky, fyziky a informatiky, Univerzita Komenského, Mlynská Dolina, 842 48 Bratislava 4, Slovensko
2 Ústav pre výskum srdca, Centrum experimentálnej medicíny SAV, Dúbravská cesta 9, 841 04 Bratislava, Slovensko
pavolmisenko.95@gmail.com

Vzdialený ischemický conditioning (RIC) pozostáva z krátkych epizód ischémie nasledovaných reperfúziou v niektorej z častí organizmu. Prvé popísanie RIC sa pripisuje dvojici Whittaker a Przyklenk, ktorí predpokladali vylúčenie "protektívnych faktorov" po krátkych epizódach ischémie. Podobným je aj stav metabolického preconditioningu (MP). Metabolický preconditioning nastáva pri akútnom diabete a vo viacerých štúdiách bola preukázaná jeho ochranná účinnosť na srdcové mitochondrie (Malfitano et al., 2010). Zistilo sa, že diabetes má protektívnu funkciu vo viacerých patologických procesoch, ako napríklad ischémia, hypoxia a preťaženie vápnikom (calcium overload) (Schaffer et al., 2000; Champattanachai et al., 2007). V posledných rokoch sa v súvislosti s MP dostávajú čoraz viac do popredia mitochondriálne póry prechodnej permeability (mPTP). Presné molekulárne zloženie mPTP, spolu so všetkými regulačnými dráhami, však doposiaľ nie je známe. Za hlavné zložky sa v súčasnosti považujú ATP syntáza, cyklofilín D (CyPD), adenín nukleotidový translokátor (ANT) a napätovo závislý kanál (VDAC) (Pérez et al., 2017; Bernardi et al., 2015).

Vzhľadom na multienzýmový charakter mPTP predstavuje hmotnostná spektrometria vhodnú metódou na primárny a exploratívny výskum faktorov podieľajúcich sa na MP a zložení a regulácii mPTP. Neustálym zdokonaľovaním "label-free" kvantitatívnych metód je možné uskutočňovať komparatívno-kvantitatívne experimenty pre širokú škálu proteínov vo vzorkách. Jedným z najviac používaných kvantitatívnych ukazovateľov je exponenciálne modifikovaný "protein abundance index" (emPAI), použitím ktorého je možné relatívne kvantifikovať takmer všetky proteíny identifikované vo vzorke (Ishihama et al., 2005). Zvyšovaním komerčnej dostupnosti hmotnostných spektrometrov sa stávajú experimenty využívajúce hmotnostnú spektrometriu na identifikáciu a kvantifikáciu proteínov čoraz bežnejšie. Pomocou hmotnostnej spektrometie sme schopní získať veľké množstvo dát, ktoré sú navzájom prepojené a častokrát ťažko interpretovateľné. Tento problém si preto vyžaduje vytvorenie vhodných experimentálnych a analytických prístupov umožnujúcich správnu analýzu dát a zvýšenie spoľahlivosti výsledkov.

Poďakovanie: 

Podporené grantmi VEGA 2/0121/18, APVV 15-0119 a VEGA 2/0121/18; ITMS 26230120009.

Zdroje: 

BERNARDI, Paolo; LISA, Fabio Di, 2015. The mitochondrial permeability transition pore: Molecular nature and role as a target in cardioprotection. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. Roč. 78, s. 100–106.
CAMPATTANACHAI, Voraratt; MARCHASE, Richard B.; CHATHAM, John C., 2007. Glucosamine protects neonatal cardiomyocytes from ischemia-reperfusion injury via increased protein-associated O-GlcNAc. Am J Physiol Cell Physiol. Roč. 292, s. C178–C187.
ISHIHAMA, Yasushi; ODA, Yoshiya; TABATA, Tsuyoshi; SATO, Toshitaka; NAGASU, Takeshi; RAPPSILBER, Juri; MANN, Matthias, 2005. Exponentially Modified Protein Abundance Index (emPAI) for Estimation of Absolute Protein Amount in Proteomics by the Number of Sequenced Peptides per Protein. Molecular and Cellular Proteomics. Roč. 4, s. 1265–1272.
MALFITANO, Christiane; LOUREIRO, Tatiana C. A.; RODRIGUES, Bruno; SIRVENTE, Raquel; SALEMI, Vera M. C.; RABECHI, Nara B.; LACCHINI, Silvia; CURI, Rui; IRIGOYEN, Maria Claudia C., 2010. Hyperglycaemia protects the heart after myocardial infarction: aspects of programmed cell survival and cell death. European Journal of Heart Failure. Roč. 12, s. 659–667.
PÉREZ, María José; QUINTANILLA, Rodrigo A., 2017. Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore. Developmental Biology. Roč. 426, s. 1–7.
SCHAFFER, Stephen W.; CROFT, Cherry Ballard; SOLODUSHKO, Viktoriya, 2000. Cardioprotective effect of chronic hyperglycemia: effect on hypoxia-induced apoptosis and necrosis. Am J Physiol Hearth Circ Physiol. Roč. 278, s. H1948–H1954.

Diskusia

Dobrý deň, ďakujeme za príspevok a prehľadné vypracovanie postupnosti analýz. Využitie tak komplexnej experimentálnej metódy hmotnostnej spektrometrie (MS) v proteomike, kde je cieľom porovnanie experimentálnych skupín (v tomto prípade DIA a KON) však nesie so sebou úskalia - ktorý z vykonaných experimentálnych krokov MS považujete za "najzraniteľnejší" v zmysle validity výsledkov? Ďakujem.
iwa

Prajem pekný deň a ďakujem za otázku. Vzhľadom na to, že MS je citlivá metóda, je veľmi citlivým krokom samotná LC-MS analýza. To je z dôvodu, že nie každý hmotnostný spektrometer má rovnakú citlivosť a tiež je dôležité správne spárovanie aparatúry s kvapalnou chromatografiou. Ďalším dôvodom je aj pred spracovávanie hrubých dát pomocou softvérov implementovaných výrobcami hmotnostných spektrometrov. Vzhľadom na to že je úspešnosť tohto kroku závislá od viacerých faktorov vzniká tu aj veľký priestor vznik možných chýb.

Ďakujem za odpoveď Pavol, ešte sa chcem opýtať, kam by ste zaradili použitú prístrojovú zostavu v spektre používaných aparatúr MS - či ide o priemer, štandard (lepší priemer) apod. :)
iwa

Ospravedlňujem sa za oneskorenú reakciu.
S ohľadom na súčasné štandardy hmotnostných spektrometrov by som zaradil tento prístroj do skupiny priemerných zariadení. Využívaným hmotnostným analyzátorom je iónová pasca, ktorá má dobré uplatnenie pri viacnásobných MS/MS tandemových analýzach, ale nedosahuje tak veľkú presnosť ako napríklad analyzátory na princípe fourierovej transformácie alebo linárne TOF analyzátory. Avšak za účelom exploratívnej analýzy (a do istej miery aj kvantitatívnej analýzy) je použitý prístroj dostačujúci. Pri všetkých MS experimentoch je ale veľmi dôležitá precízna a konzistentná príprava vzorky, vzhľadom na veľkú citlivosť merania.

Dobry den,
Ako jeden s cielov ste uviedli aj vytvorenie experimentalneho navrhu ale vo vysledkoch ste sa mu nevenovali. Ako by mal teda optimalne podobny experiment vyzerat?

Prajem pekný deň.
Návrh presného experimentálneho postupu je veľmi závislí od typu analýzy a skúmanej vzorky. Jedným z najdôležitejších faktorov je opakovanie meraní na vzorke z toho istého subjektu, čím je možné odhodnotiť chybu spôsobenú nepresnosťami MS merania. Ohodnotenie tejto chyby je dôležité aj z hľadiska reprodukovateľnosti výsledkov a porovnávania výsledkov v rámci rôznych experimentálnych tímov, ktoré môžu používať hmotnostný spektrometer s rozdielnou citlivosťou.