Gold nanoparticles-enhanced biosensors for study of protease activity

Gold nanoparticles-enhanced biosensors for study of protease activity

Celkové hodnotenie

Vedecká práca
100%
Prevedenie (dizajn)
100%
Diskusná interakcia
PoužívateľVedecká prácaDizajnDiskusná interakcia
Mgr. Natália Andelová PhD.100%100%-
Mgr. Lucia Ilavská100%100%-
ISBN: 978-80-972360-6-9

Gold nanoparticles-enhanced biosensors for study of protease activity

Ivan Piovarči1 , Tibor Hianik ,
1 Univerzita Komenského v Bratislave, Bratislava 1, Slovensko
piovarci.i@gmail.com

This work is focused on the preparation and improvement of biosensors for monitoring protease activity. Proteases play an important role in various biological processes as well as in the dairy industry. Milk proteases like plasmin or trypsin play important role in shelf-life of milk where the inactivation of these proteases is essential for improving the shelf-life of milk. In the case of cheese products, however, the activity of plasmin is essential for the correct manufacturing of curd [1]. In dairy industry there is still a lack of universal method for determination of protease activity in milk that would be fast, cheap and sensitive [2].

In this work, we focused on the possibility of spectrophotometric methods for monitoring the activity of one of the milk proteases: trypsin. To monitor the activity we used gold nanoparticles, which we modified with milk protein: β-casein. We characterized the change in absorption spectra after casein modification. Subsequently, it was necessary to further modify these nanoparticles with 1-mercaptohexanol (MCH), which made it possible to measure the aggregation of these gold nanoparticles by changing their absorption spectra after adding different concentrations of trypsin [3]. We measured absorption spectra every 15 minutes up to one hour after trypsin addition. By monitoring the absorption maximum, its change of position and change in absorbance, we made a calibration curve and then calculated the detection limit (LOD = 0,05 nM).

We also focused on chymotrypsin detection using the acoustic shear method (TSM). In this case, β-casein was immobilized on the surface of the TSM transducer - piezo-crystal. The addition of chymotrypsin resulted in an increase in resonance frequency, f, and a decrease in dynamic resistance, R, indicating cleavage of short peptide fragments from β-casein and demonstrates protease activity. We demonstrated that the modification of the substrate, β-casein, with gold nanoparticles increased the sensitivity of detection at least twice. Both methods could represent a novel approach for detection of proteases in dairy industry.

Poďakovanie: 

This work has received funding from the European Union’s Horizon 2020 research and innovation programme under the Marie Skłodowska-Curie grant agreement No 690898.

Zdroje: 

[1] Ismail, B., & Nielsen, S. S. (2010). Invited review: Plasmin protease in milk: Current knowledge and relevance to dairy industry. J. Dairy Sci. 93, 4999-5009.
[2] Meshram, B.D. & Agrawal, Ashok & Adil, Shaikh & Ranvir, Suvartan & Sande, K.K.. (2018). Biosensor and its Application in Food and Dairy Industry: A Review. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7. 3305-3324. 10.20546/ijcmas.2018.702.397.
[3] Chuang, Yao Chen & Li, Jung-Chun & Chen, Sz-Hau & Liu, Ting-Yu & Kuo, Ching-Han & Huang, Wei-Ting & Lin, Chih-Sheng. (2010). An optical biosensing platform for proteinase activity using gold nanoparticles. Biomaterials. 31. 6087-95. 10.1016/j.biomaterials.2010.04.026.

Diskusia

Dobry den, zaujal ma vas prispevok, v ktorom navrhujete dve nove analyticke metody. Aka je aktulane pouzivana metoda na stanovenie proteazovej aktivity v potravinarskej praxi? Vami navrhovane metody splnaju kriteria z abstraktu, ze su v porovnani so sucasnou metodou "rychlejsie, lacnejsie a senzitivnejsie"? Viete vycislit jednotkovu cenu na stanovenie proteazovej aktivity s pouzitim zlatom obohatenych nanocastic a porovnat ju s aktualne pouzivanou metodikou? Budete Vami navrhovane postupy aj validovat a chranit patentovou ochranou? Ake sa vase dalsie zamery vo vyskume? Vopred dakujem za odpovede, ZB

Dobrý deň, veľmi pekne ďakujem za otázky. Jedna z metód ktorá sa používa v praxi je ELISA metóda, ktorá sa predáva v kitoch väčšinou na 100 testov v cenách okolo 300-500€, čiže asi 3-5 € za test. Pri našej metóde je potrebné nasyntetizovať zlaté nanočastice, pričom na jednu testovaciu vzorku vychádza cena chemikálií približne 0,05 €. Čo sa týka senzitivity ELISA kity majú senzitivitu medzi 0,01 nM - 100 nM, takže senzitivitou sa naša metóda blíži ale nie je najlepšia. Pri porovnaní rýchlosti sme síce zlaté nanočastice modifikovali a pripravovali približne 1-2 dni, po príprave však boli použiteľné ihneď na 15-30 min. meranie v absorpčnom spektrometri, zatiaľ čo pre ELISA kity je potrebné modifikovať ich tesne pred meraním aj niekoľko hodín. Metódu by bolo určite ešte treba validovať. Čo sa týka patentovej ochrany, nakoľko boli nanočastice využité podobným spôsobom na detekciu aktivity iných proteáz v iných článkoch, nie je možné pre nás metodiku patentovať. Čo sa týka mojich zámerov do budúcna, zatiaľ budem pokračovať v štúdiu proteázovej aktivity, aby som vylepšil predostrenú metodiku a rozšíril ju na komplement všetkých proteáz v mlieku. Pevne tiež verím, že táto metodika by dokázala otvoriť dvere do medicíny, kde by podobným spôsobom bolo možné sledovať aktivitu významných biologických proteáz v tele a bolo by možné zlepšiť diagnostiku a sledovanie liečby napríklad pri pacientoch s poruchami zrážanlivosti krvi.

Dobrý deň, veľmi pekne ďakujem za otázky. Jedna z metód ktorá sa používa v praxi je ELISA metóda, ktorá sa predáva v kitoch väčšinou na 100 testov v cenách okolo 300-500€, čiže asi 3-5 € za test. Pri našej metóde je potrebné nasyntetizovať zlaté nanočastice, pričom na jednu testovaciu vzorku vychádza cena chemikálií približne 0,05 €. Čo sa týka senzitivity ELISA kity majú senzitivitu medzi 0,01 nM - 100 nM, takže senzitivitou sa naša metóda blíži ale nie je najlepšia. Pri porovnaní rýchlosti sme síce zlaté nanočastice modifikovali a pripravovali približne 1-2 dni, po príprave však boli použiteľné ihneď na 15-30 min. meranie v absorpčnom spektrometri, zatiaľ čo pre ELISA kity je potrebné modifikovať ich tesne pred meraním aj niekoľko hodín. Metódu by bolo určite ešte treba validovať. Čo sa týka patentovej ochrany, nakoľko boli nanočastice využité podobným spôsobom na detekciu aktivity iných proteáz v iných článkoch, nie je možné pre nás metodiku patentovať. Čo sa týka mojich zámerov do budúcna, zatiaľ budem pokračovať v štúdiu proteázovej aktivity, aby som vylepšil predostrenú metodiku a rozšíril ju na komplement všetkých proteáz v mlieku. Pevne tiež verím, že táto metodika by dokázala otvoriť dvere do medicíny, kde by podobným spôsobom bolo možné sledovať aktivitu významných biologických proteáz v tele a bolo by možné zlepšiť diagnostiku a sledovanie liečby napríklad pri pacientoch s poruchami zrážanlivosti krvi.

Dobrý deň, veľmi pekne ďakujem za otázky. Jedna z metód ktorá sa používa v praxi je ELISA metóda, ktorá sa predáva v kitoch väčšinou na 100 testov v cenách okolo 300-500€, čiže asi 3-5 € za test. Pri našej metóde je potrebné nasyntetizovať zlaté nanočastice, pričom na jednu testovaciu vzorku vychádza cena chemikálií približne 0,05 €. Čo sa týka senzitivity ELISA kity majú senzitivitu medzi 0,01 nM - 100 nM, takže senzitivitou sa naša metóda blíži ale nie je najlepšia. Pri porovnaní rýchlosti sme síce zlaté nanočastice modifikovali a pripravovali približne 1-2 dni, po príprave však boli použiteľné ihneď na 15-30 min. meranie v absorpčnom spektrometri, zatiaľ čo pre ELISA kity je potrebné modifikovať ich tesne pred meraním aj niekoľko hodín. Metódu by bolo určite ešte treba validovať. Čo sa týka patentovej ochrany, nakoľko boli nanočastice využité podobným spôsobom na detekciu aktivity iných proteáz v iných článkoch, nie je možné pre nás metodiku patentovať. Čo sa týka mojich zámerov do budúcna, zatiaľ budem pokračovať v štúdiu proteázovej aktivity, aby som vylepšil predostrenú metodiku a rozšíril ju na komplement všetkých proteáz v mlieku. Pevne tiež verím, že táto metodika by dokázala otvoriť dvere do medicíny, kde by podobným spôsobom bolo možné sledovať aktivitu významných biologických proteáz v tele a bolo by možné zlepšiť diagnostiku a sledovanie liečby napríklad pri pacientoch s poruchami zrážanlivosti krvi.