Vývoj elektrochemických biosenzorov na báze redoxne značených aptamérov na diagnostiku onkologických ochorení

Vývoj elektrochemických biosenzorov na báze redoxne značených aptamérov na diagnostiku onkologických ochorení

Celkové hodnotenie

Vedecká práca
97%
Prevedenie (dizajn)
100%
Diskusná interakcia
100%
PoužívateľVedecká prácaDizajnDiskusná interakcia
Mgr. Natália Andelová PhD.100%100%-
Veronika Subjakova100%100%100%
Mgr. Lucia Ilavská100%100%100%
Bc. Karin Vančíková100%100%100%
Mgr. Marta Kollárová100%100%100%
Mgr. Šimon Šutý80%100%100%
Mgr. Juraj Jacko100%100%100%
ISBN: 978-80-972360-6-9

Vývoj elektrochemických biosenzorov na báze redoxne značených aptamérov na diagnostiku onkologických ochorení

Cyril Slabý1 , Lenka Bábelová2 , T. Hianik ,
1 Katedra Jadrovej Fyziky a Biofyziky, Fakulta Matematiky, Fyziky a Informatiky, Univerzita Komenského, Bratislava, Slovensko
2 Ústav biochémie a genetiky živočíchov, Centrum biovied SAV, Bratislava, Slovensko
slaby.cyril@gmail.com

Úmrtnosť na niektoré závažné kardiovaskulárne a infekčné ochorenia sa v posledných desaťročiach významne znížila. Podobne je to aj s onkologickými ochoreniami. Avšak určité typy karcinómov naďalej nie je možné úspešne liečiť, najmä ak sú diagnostikované príliš neskoro [1]. Najčastejším onkologickým ochorením u detí je akútna lymfoblastická leukémia (ALL). V čase, kedy je ALL diagnostikovaná štandardnými metódami, býva už takmer celá populácia zdravých lymfocytov nahradená leukemickým typom. K súčasne využívaným metódam diagnostiky ALL patrí vyšetrenie krvného obrazu a mikroskopického leukogramu. Diagnózu potvrdzuje biopsia kostnej drene [2].

Veľký potenciál pre zdokonalenie diagnostických metód onkologických ochorení, vrátane ALL, má vývoj biosenzorov. Biosenzory sú analytické zariadenia, ktorých detekčnú časť, receptor, tvorí biologický prvok. V dnešnej dobe asi najčastejšie študovanými typmi bioreceptorov sú aptaméry. Aptaméry sú jednovláknové DNA alebo RNA oligonukleotidy. Unikátnou vlastnosťou aptamérov je zmena ich 3D konformácie v prítomnosti špecifického typu molekúl a tvorba väzbového miesta pre tieto molekuly. Biosenzory, ktoré ako receptory využívajú aptaméry, nazývame aptasenzory [3].

V práci sme sa venovali optimalizácii aptasenzorov na detekciu T-lymfoblastov akútnej lymblastickej leukémie. Ako detekčný prvok slúžil aptamér sgc8c, ktorý je špecifický pre proteín tyrozín kinázu 7 v membráne T-lymfoblastov. Testovali sme dva rôzne elektrochemicky modifikované aptaméry. Prvý, k tvorbe signálu, využíval ferocén-karboxylovú kyselinu, ktorú sme v procese imobilizácie naväzovali na aptamér. Druhý využíval metylénovú modrú, ktorá bola kovalentne pripojená k  aptaméru. Získané výsledky z detekcie T-lymfoblastov prostredníctvom diferenciálnej pulznej voltamerie potvrdzujú schopnosť aptasenzorov detegovať leukemické bunky v širokom rozsahu koncentrácií (50 – 5 000 buniek/ml) s limitom detekcie 4851 buniek/ml a 7841 buniek/ml.

Poďakovanie: 

Táto práca bola podporená vedeckou grantovou agentúrou VEGA, číslo projektu: 1/0419/20.

Zdroje: 

[1]    R. McPherson, M. Pincus, Henry’s clinical diagnosis and management by laboratory methods. 2017 by Elsevier Inc.  1433-1442.
[2]    A.Kolenova, E. Kaiserova, Pediatr. prax, 2012, 13(4): 161 - 165.
[3]    T. Hianik, J. Wang,  Electroanalysis 2009, 21, No. 11, 1223 - 1235.

Diskusia

Dobrý deň Cyril,
veľmi pekná práca, jasne zdôvodnený zámer, metodický postup, aj prezentácia aj interpretácia výsledkov, aj záver o citlivosti testovaných aptasenzorov. Vzhľadom na aktuálnosť problematiky agresívnych onkologických diagnóz ma zaujíma, aká je špecifickosť týchto aptasenzorov - či vykazuje selektivitu (senzitivitu voči transformovaným T bunkám a "nevšíma si" netransformované). Robili ste experimenty, alebo plánujete experimentálne testovať aptasenzory aj s iným typom buniek? Aká bunková línia by bola vhodnou kontrolou?
S pozdravom,
iwa

Dobrý deň. Ďakujem za otázky. Aptasenzory sme testovali aj v prítomnosti kontrolných buniek U266. Tieto PTK7-negatívne B-lymfocyty s aptasenzorom neinteragovali. Zatiaľ sme mali k dispozícii iba tento jeden typ PTK7-negatívnych buniek. Pre kontrolu selektivity je vhodný akýkoľvek typ B- alebo T-lymfocytov, ktoré v membráne neobsahujú PTK7.

Ešte dodatočná otázka k zistenému detekčnému limitu. V abstrakte uvádzate, že "V čase, kedy je ALL diagnostikovaná štandardnými metódami, býva už takmer celá populácia zdravých lymfocytov nahradená leukemickým typom. K súčasne využívaným metódam diagnostiky ALL patrí vyšetrenie krvného obrazu a mikroskopického leukogramu." Rozumiem tomu správne, že aptasenzor vďaka vysokošpecifickej interakcii deteguje transformované bunky a súčasne je zvolená metóda dostatočne citlivá na zachytenie signálu, aj keď by (hypoteticky) koncentrácia cirkulujúcich buniek bola ešte veľmi nízka? Ďakujem.
iwa

Koncentrácia lymfocytov v periférnej krvi je približne 1000000 buniek/ml. Citlivá diagnostická metóda by mala byť schopná detegovať jednu leukemickú bunku na 10000 zdravých buniek. Naša metóda zatiaľ nie je dostatočne citlivá, pretože detekčné limity, ktoré sme získali nedosahujú túto hranicu. Ešte nedokážeme detegovať veľmi nízke koncentrácie transformovaných PTK7-pozitívnych buniek. Avšak, máme v pláne modifikovať aptasenzory nanoštruktúrnymi zlúčeninami (oxid grafénu), ktoré sa využívajú na amplifikáciu signálu s cieľom získať detekčný limit, ktorý bude spĺňať túto podmienku.

Ďakujem za odpoveď a želám veľa úspechov a možností pokračovať vo výskume.
iwa