Objasnenie funkcie proteínu Dbl2 v udržiavaní stability nukleozómov v bunkách S. pombe

Objasnenie funkcie proteínu Dbl2 v udržiavaní stability nukleozómov v bunkách S. pombe

Celkové hodnotenie

Vedecká práca
100%
Prevedenie (dizajn)
100%
Diskusná interakcia
100%
PoužívateľVedecká prácaDizajnDiskusná interakcia
Bc. Daniela Máčalová100%100%100%
Mgr. Alexandra Piteľová100%100%100%
Mgr. Lívia Petrisková100%100%100%
Tereza Goliaš100%100%100%
Mgr. Peter Alaxin100%100%100%
ISBN: ISBN 978-80-972360-7-6

Objasnenie funkcie proteínu Dbl2 v udržiavaní stability nukleozómov v bunkách S. pombe

Alexandra Piteľová1 , Ivana Mišová , Jaroslav Budiš2,3,4 , Juraj Gazdarica5 , Tatiana Sedláčková , Tomáš Szemes , Silvia Bágeľová Poláková ,
1 Centrum biovied SAV, Ústav biochémie a genetiky živočíchov, Bratislava, Slovenská republika
2 Vedecký park Univerzity Komenského, Bratislava, Slovenská republika
3 Geneton Ltd., Bratislava, Slovenská republika
4 Centrum vedecko-technických informácií SR, Bratislava, Slovenská republika
5 Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra molekulárnej biológie, Bratislava, Slovenská republika
alexandra.pitelova@savba.sk

Súčasne prebiehajúce projekty súvisiace s novoobjaveným proteínom Dbl2 v bunkách kvasinky Schizosaccharomyces pombe, sú zamerané najmä na objasnenie jeho funkcie. Z predchádzajúcich experimentov je známe, že Dbl2 sa podieľa najmä̈ na správnom priebehu mitózy, meiózy a lokalizácii helikázy Fbh1, ktorá je dôležitá v procese homologickej rekombinácie, kde odstraňuje proteín Rad51 z Rad51-ssDNA filamentu [1]. V priebehu analýzy proteín-proteínových interakcií prostredníctvom kvasinkového dvojhybridného systému bol v prípade Dbl2 pozorovaný zaujímavý jav, a to, že fúzia génu dbl2 a GAL4 DNA-viažucej domény spúšťa expresiu reportérového génu. Tento objav naznačoval funkciu proteínu Dbl2 v génovej expresii. 

V bunkách S. pombe je represia génovej expresie zabezpečovaná viacerými spôsobmi. Naším hlavným cieľom v tejto práci bude zapojiť proteín Dbl2 do jednej z  dráh vedúcich k utlmovaniu génovej expresie a priniesť nové informácie o mechanizme, akým sa môže proteín homologickej rekombinácie podieľať aj na systematickej regulácii génovej expresie.

Výsledky našich experimentov ukázali, že delécia génu dbl2 je v bunkách S. pombe sprevádzaná zmenou v expresii mnohých lokusov. Expresia väčšiny týchto lokusov je súčasne regulovaná aj proteínom Hip1, ktorý je jednou z podjednotiek histón šaperónového komplexu HIRA. V neprítomnosti funkčného variantu proteínu Hip1 dochádza k narušeniu normálnej hladiny expresie centromerických oblastí [2], pričom súčasná delécia génov dbl2 hip1 dokáže prinavrátiť normálny stav, čo naznačuje ich opozitnú funkciu v procese génovej represie. Navyše sme ukázali, že delécia génu dbl2 ovplyvňuje stabilitu -2, -1 a +1 nukleozómu v okolí začiatkov transkripcie, čo naznačuje zapojenie proteínu Dbl2 v procese destabilizácie nukleozómov a celkovej zmeny architektúry chromatínu v bunkách S. pombe.

Poďakovanie: 

Práca vznikla s finančnou podporou grantov APVV-18-0219 a VEGA 2/0034/19.

Zdroje: 

[1] Polakova S., Molnarova L., Hyppa R., et al. (2016) PLoS Genet. 12(6): e1006102.
[2] Yamane K., Mizuguchi T., Cui B., et. al. (2011) Mol. Cell 41(1), p. 56–66.

Diskusia

Dobry den,
kedze sa vobec neorientujem vo Vasej teme a metodike, mohli by ste mi, prosim, v skratke vysvetlit grafy C a D? Mam pocit, ze osi X rozumiem, ale ako sa meria ta frekvencia pozicie nukleozomu a co znamenaju jej vyssie a nizsie cisla? Ospravedlnujem sa za moje nechapanie, ale zaujalo ma, ako sa z tych grafov da vycitat architektura chromatinu a stabilita nukleozomov. Mockrat dopredu dakujem a prajem vela zaujimavych vysledkov aj do buducna.

Zdravim,
rada vysvetlim. My vzdy pracujeme s populaciou asynchronnych buniek, tzn. s populaciou rôzne starych buniek a buniek v rôznych fazach bunkoveho cyklu. Nukleozomy su struktury, ktore dynamicky odpovedaju na vsetky tieto faktory, preto je v grafe uvedena ich frekvencia za danych podmienok.

My dokazeme specificky purifikovat iba tie fragmenty DNA, ktore su sucastou nukleozomov. Tieto fragmenty su nasledne sekvenovane a mapovane na genom. Ak sa nejaky konkretny nukleozom nachadza v genome analyzovanej populacie buniek castejsie v rovnakej pozicii (s vyssou frekvenciou), v nasich vzorkach bude pritomnych viac fragmentov zodpovedajucich danemu nukleozomu, co sa odrazi na vacsom pocte namapovanych sekvenacnych readov zodpovedajucich danej oblasti (nukleozomu).

Nukleozomy su struktury, ktore musia dynamicky reagovat na mnoho procesov prebiehajucich v bunke. Castokrat su cyklicky ukladane a odstranovane z molekuly DNA v zavislosti od potrieb bunky. V nasich grafoch je pre lahsie porovnanie vzdy zobrazeny nukleozomovy profil standardneho kmena (wt) a mutanta (hip1 alebo dbl2). Ak je u mutanta frekvencia nejakeho nukleozomu vyssia ako v standardnom kmeni, mozeme povedat, ze mutantne vzorky obsahovali viac fragmentov DNA zodpovedajucich danemu nukleozomu. Z toho vyplyva, ze pozicia daneho nukleozomu v genome je v mutantnych bunkach pravdepodobne konzervovanejsia ako v pripade standardnych buniek, co naznacuje aj jeho vyssiu stabilitu.

Ak by bolo stale nieco nejasne, rada odpoviem :)