Preclinical evaluation of the novel aldose reductase inhibitor cemtirestat: relationship of Ki vs IC50 by Cheng-Prusoff equations

Preclinical evaluation of the novel aldose reductase inhibitor cemtirestat: relationship of Ki vs IC50 by Cheng-Prusoff equations

Celkové hodnotenie

Vedecká práca
99%
Prevedenie (dizajn)
97%
Diskusná interakcia
98%
PoužívateľVedecká prácaDizajnDiskusná interakcia
MUDr. Natália Babincová100%100%100%
Cynthia Sárkányová100%100%100%
Kristína Almášiová100%100%-
Mgr. Petra Smrekova MBA100%100%100%
Dominika Bulková100%100%100%
Ing. Júlia Konkoľová100%100%100%
Mgr. Soňa Folvarčíková100%80%100%
Mgr. Marta Ďuriš100%100%100%
Tomáš Čičvák100%100%100%
Zdenka Kalová100%100%-
Ing. Zuzana Brnoliaková PhD.80%80%80%
Mgr. Ľuboš Hudák100%100%100%
Bc Zuzana Novákiová100%100%100%
Marek Hrebík100%100%100%
MUDr. Daniela Hrebíková100%100%100%
Michaela Ľašová100%100%100%
Mgr. Lea Kissová100%100%100%
RNDr. Magdaléna Májeková PhD.100%80%80%
Mgr. Peter Šramel PhD.100%100%100%
ISBN: ISBN 978-80-972360-7-6

Preclinical evaluation of the novel aldose reductase inhibitor cemtirestat: relationship of Ki vs IC50 by Cheng-Prusoff equations

Pavol Boďo1 , Marta Prnová Šoltésová , Milan Štefek ,
1 Ústav experimentálnej farmakológie a toxikológie, Centrum experimentálnej medicíny, Slovenská akadémia vied, Bratislava, Slovensko
bodik.pali@gmail.com

Cemtirestat, 2-(3-thioxo-2H-[1,2,4]triazino[5,6-b]indol-5(3H)-yl) acetic acid, was recently designed and patented as a highly selective and efficient aldose reductase inhibitor  endowed with antioxidant activity (Stefek et al. 2015; Šoltesova Prnova et al. 2020). Presently the compound is under complex preclinical evaluation as a promising drug to treat diabetic complications. The aim of the present study was to compare two methods of determination of cemtirestat inhibition constant (Ki).

At the very beginning, Michaelis-Menten constant (Km) value for aldose reductase mediated reduction of the glyceraldehyde substrate, was determined. Then cemtirestat was subjected to inhibition assessment by two approaches. In the first way, concentrations of inhibitor for 50% inhibition (IC50) of rat lens aldose reductase by cemtirestat were determined for three different concentration of the glyceraldehyde substrate, S<>Km.  In the second way, inhibition constant Ki was determined by applying enzyme kinetics approach with Lineweaver-Burk plot.  To relate the IC50 values to the inhibition constant Ki, the method based on modified Cheng and Prusoff equations (Brandt et al., 1987), was used. To conclude, both approaches revealed an uncompetitive type of aldose reductase inhibition by cemtirestat and both methods yielded comparable Ki values. 

Cemtirestat, kyselina 2-(3-tioxo-2H-[1,2,4]triazino[5,6-b]indol-5(3H)-yl) octová, bol nedávno navrhnutý a patentovaný ako vysoko selektívny a efektívny inhibítor aldózareduktázy s antioxidačnou aktivitou (Štefek et al. 2015; Šoltésová Prnová et al. 2020). V súčasnosti sa  zlúčenina nachádza v štádiu komplexného predklinického hodnotenia ako potencionálne liečivo voči diabetickým komplikáciám. Cieľom tejto štúdie bolo porovnať dve metódy stanovenia inhibičnej konštanty (Ki) cemtirestatu.

Na začiatku bola stanovená Michaelis-Mentenovej konštanta (Km) pre aldózareduktázu, ktorá ako substrát využíva glyceraldehyd. Následne sa pomocou dvoch rôznych prístupov hodnotila inhibícia aldózareduktázy cemtirestatom. V prvom prípade sa koncentrácia inhibítora pre 50% inhibíciu (IC50) aldózareduktázy pochádzajúcej z potkaních šošoviek stanovila pre tri rôzne koncentrácie substrátu, glyceraldehydu, a to pre S<>Km. V druhom prípade bola inhibičná konštanta Ki určená aplikovaním metód enzýmovej kinetiky a grafu Lineweaver-Burka. Stanovené hodnoty IC50 a inhibičnej konštanty Ki boli uvedené do vzťahu pomocou modifikovaných Chengových a Prusoffových rovníc (Brandt et al. 1987). Prostredníctvom oboch prístupov sa určil akompetitívny typ inhibície aldózareduktázy cemtirestatom a obe metódy poskytli porovnateľné hodnoty Ki.

Poďakovanie: 

This work was supported by VEGA 2/0005/2018 and APVV-15-0455.

Táto práca bola podporená projektami VEGA 2/0005/2018 a APVV-15-0455.

Zdroje: 

Brandt RB, Laux JE, Yates SW. Calculation of inhibitor Ki and inhibitor type from the concentration of inhibitor for 50% inhibition for Michaelis-Menten enzymes. Biochem Med Metab Biol1987; 37:344-9.
Soltesova Prnova M, Medina-Campos ON, Pedraza-Chaverri J, Colín-González AL, Piedra-García F, Rangel-López E, Kovacikova L, Ceylan A, Karasu C, Santamaria A, Stefek M. Antioxidant Mechanisms in the Neuroprotective Action of Cemtirestat: Studies in Chemical Models, Liposomes and Rat Brain Cortical Slices. Neuroscience2020; 443: 206-217.
Stefek M, Soltesova Prnova M, Majekova M, Rechlin C, Heine A, Klebe G. Identification of novel aldose reductase inhibitors based on carboxymethylated mercaptotriazinoindole scaffold. J Med Chem2015; 58: 2649-57.

Diskusia

Dobrý deň,
Vaša práca ma značne zaujala, najmä časť o enzýme aldózareduktáza, kam smeruje aj moja otázka. Považujeme tento enzým za čisto škodlivý v našom organizme, ak sa ho teda snažíme inhibovať, alebo má aj nejakú prospešnú funkciu?
Za odpoveď ďakujem.

Dobrý deň,
Vaša práca ma značne zaujala, najmä časť o enzýme aldózareduktáza, kam smeruje aj moja otázka. Považujeme tento enzým za čisto škodlivý v našom organizme, ak sa ho teda sna...nky. Rovnako sa ALR2 zúčasťnuje aj na syntéze PGF2 alfa z H2, rovnako aj sorbitol je dôležitý pre osmolytickú reguláciu. Preto je ALR2 takmer neškodný pri normoglykemických podmienkach. Problémom je práve hyperglykémia a následne zvýšená aktivita tohto enzýmu.

Dobrý deň, v prvom rade Vám chcem povedať, že vaša práca je skvelá. Som rada, že aj na Slovensku máme tak šikovných vedcov ako ste vy. V prezetnácii spomínate, že ste ako substrát použili glyceraldehyd. Pre enzýmy je charakteristická ich špecidickosť, teda že katalyzujú premenu len jedného substrátu/enantioméru. Použili ste vo vašom experimente špecifický substrát? D alebo L glyceraldehyd?
Vopred ďakujem za odpoveď a prajem pekný deň.

Dobrý deň, ďakujeme za povzbudivé slová.
Áno, enzyme sú charakteristické tým, že katalyzujú premenu špecifických substrátov (aj enantiomérov). V našom prípade dochádza k redukcii glyceraldehydu na glycerol. Pre nezým aldózareduktázu je charakteristické, že premieňa oba eneatioméry (D aj L) na glycerol (pre jeden z nich má však vyššiu špecifcitu, avšak momentálne Vám neviem povedať, pre ktorú). Preto sme použili zmes oboch enantiomérov. Prajem príjemný zvyšok dňa.

Dobry den, zaujimava praca, blahozelam k vysledkom. Vo svojej prezentacii spominate Epalrestat, ako jediny klinicky pouzivany AR inhibitor, dostupny vsak len v krajinach Japonsko a India. Bohuzial, Eplarestat ma aj neziaduce ucinky. Mozete specifikovat, pre ostatnych ucastnikov konferencie PREVEDA 2021, ake a v akej incidencii? Logicky prichadza otazka, ci mate overenu toxicitu Vami prezentovanej latky, v porovnani s Epalrestatom, aby bolo mozne pripadne neziaduce ucinky v klinickej praxi bud vylucit resp. aspon minimalizovat? Vopred dakujem za zhodnotenie, ZB

Dobrý deň, ďakujeme.

Čo sa týka negatívnych účinkov Epalrestatu – najčastejšie nežiadúce účinky sú poškodenia pečene (dysfunkcia), zvracanie, tráviace ťažkosti, hnačka, edém, zhoršenie renálnych funkcií. Incidencia (z publikovaného článku Sharma SR, Sharma N: Ann Indian Acad Neurol, 2008, 11) sa nežiadúce účinky z 2190 prípadov objavili pri 52. Práve poškodenia pečene patrili k najčastejším vedľajším účinkom (takmer 37%), tráviace ťažkosti predstavovali 10% nežiadúcich účinkov, ostatné nežiadúce účinky sa pohybovali okolo 1% - 2%.

Toxicita cemtirestatu bola uskutočnená – na základe in silico výpočtov bol na základe výsledkov cemtirestat vyhodnotený ako zlúčenina s triedou toxicity 4 (teda netoxický). Rovnako sa uskutočnili pokusy in vitro a in vivo, z ktorých cemtirestat v porovnaní s klinicky používaným Epalrestatom ukázal pozoruhodne nízku cytotoxicitu v niekoľkých rôznych bunkových kultúrach (MTT proliferačný test; test neutrálnej červenej farby, ktoré viažu životaschopné bunky do lyzozómov; inkorporácia BrdU; sfarbenie DNA prietokovou cytometriou použitím propídium jodidu). Rovnako sa uskutočnil dlhodobejší test orálneho podávania cemtirestatu potkanom kmeňa Wistar, kedy sa nepozorovali žiadne zmeny správania alebo toxické prejavy podávanej látky.

Dakujem za objasnenie, vela sil do vasej dalsej prace. S pozdravom, ZB