Produkcia peptidoglykán-hydroláz fágov infikujúcich Pseudomonas aeruginosa

Produkcia peptidoglykán-hydroláz fágov infikujúcich Pseudomonas aeruginosa

Celkové hodnotenie

Vedecká práca
100%
Prevedenie (dizajn)
100%
Diskusná interakcia
100%
PoužívateľVedecká prácaDizajnDiskusná interakcia
Tereza Goliaš100%100%100%
M.Sc. Justyna Płoska100%100%100%
ISBN: 978-80-972360-6-9

Produkcia peptidoglykán-hydroláz fágov infikujúcich Pseudomonas aeruginosa

Gabriela Krasňanská1 , Zuzana Šramková2 ,
1 Katedra biológie, Fakulta prírodných vied, Univerzita sv. Cyrila a Metoda v Trnave
2 Ústav molekulárnej biológie, Slovenská akadémia vied, Bratislava
gabrielakrasnanska1@gmail.com

Infekcie a ochorenia spôsobené baktériami mali v minulosti na človeka letálny dopad. Objav penicilínu ako významného antibiotika zabezpečilo liečbu ochorení, avšak éra antibiotík so sebou prináša tiež aj negatívnu stránku. Nadmerné používanie antibiotík viedlo k vzniku rezistencie baktérií na antibiotiká. Objavujú sa kmene nesúce rezistenciu nie voči jednému, ale aj viacerým dostupným antibiotikám, na základe čoho sa označujú ako multirezistentné baktérie. Významní predstavitelia multirezistentných baktérií pochádzajú aj z rodu Pseudomonas. Ako sľubná alternatíva sa ukazuje využitie fágových lytických enzýmov, peptidoglykán-hydroláz (PGH). Tieto proteíny môžu i) byť asociované s viriónom a ich úlohou je degradácia bunkovej steny pre injekciu fágovej DNA do bakteriálnej bunky, alebo ii) ako endolyzíny umožňujú uvoľnenie nových zrelých fágových častíc destabilizáciou peptidoglykánovej vrsty baktariálnej bunky na konci lytického cyklu.

Dva gény kódujúce peptidoglykán-hydrolázy bakteriofágov TC6 a PAK_P4 boli vybrané pre experimentálne overenie ich funkcie na základe uskutočnených in silico analýz PGH pseudomonádových fágov (Šťastná, 2019). Vytipované gény boli komerčne syntetizované (Gene Universal Inc., Newark, USA) a dodané ako súčasť vektora pET21a(+). Heterologická expresia génov kódujúcich lytické enzýmy sa úspešne uskutočnila v expresnom kmeni E.coli BL21(DE3)pLysS, v ktorom sa potvrdila nadprodukcia rekombinantných proteínov LysTC6 a LysPAK_P4 v solubilnej forme. Úspešnosť expresie, overenie prítomnosti proteínov vo frakcii obsahujúcej solubilné proteíny ako aj úspešnosť purifikácie pomocou afinitnej chromatografie na imobilizovaných iónoch kovu bola potvrdená analýzou vzoriek pomocou elektroforézy v polyakrylamidovom géli v prítomnosti dodecylsíranu sodného.

Získané proteíny sú pripravené pre testovanie ich i) schopnosti degradovať peptidoglykán a ii) antibakteriálnej aktivity. Výsledky možno ďalej aplikovať pri vytvorení enzybiotika účinného voči druhom z rodu Pseudomonas ako aj iným gramnegatívnym baktériám.

Poďakovanie: 

Poďakovanie: Výskum bol finančne podporený projektom APVV-16-0173.

Zdroje: 

Šťastná L. (2019) Peptidoglykán-hydrolázy bakteriofágov infikujúcich pseudomonády (Diplomová práca) – Univerzita sv. Cyrila a Metoda v Trnave, Fakulta prírodných vied, Katedra biológie. 83 s.

Diskusia

Držím palce, aby Vami naprodukované peptidoglykán-hydrolázy boli účinné na rezistentných Pseudomonas! Krásne ste ich dokázali naindukovať a purifikovať. Môžem sa opýtať, čo by mohli byť bandy vo veľkosti 17 kDa na PAGE s LysPAK_P4?

Dobrý deň,
ďakujem Vám za podnetný príspevok. Testovanie aktivity peptidoglykán-hydroláz bolo pôvodne v pláne, avšak Covid tieto plány pozmenil a tiež zastavil prácu v laboratóriu.

Uvádzam niekoľko dôvodov prítomnosti dvoch bandov pozorovaných po purifikácii na PAGE s LysPAK_P4:

- degradácia proteínu vplyvom proteáz počas purifikácie (pracovala som pri zníženej teplote okolia; naväzovanie proteínu na náplň prebiehalo pri 4°C; počas purifikácie frakcie boli chladené, avšak neboli použité inhibítory proteináz, preto ich vplyv sa nedá jednoznačne vylúčiť);

- vplyv redukčného činidla vo vzorkovom roztoku (SDS-PAGE), ktoré môže spôsobiť rozdielnu rýchlosť migrácie proteínu, čo sa prejaví vznikom 2 pásov (čiže ide o jeden proteín v pôvodnej vzorke, ktorý sa však na géli javí ako dva rôzne veľké polypeptidy)

- chemická degradácia polypeptidu (počas varu) v dôsledku prítomnosti väzby Asp-Pro v proteíne LysPAK_P4. Väzba je prítomná v pozícii, v ktorej ak by degradácia nastala, výsledný produkt by mohol zodpovedať pásu s menšou MW. Rozpad sa deje v kyslejšom pH, pričom pH použitého vzorkového roztoku obsahujúceho Tris bolo 6,8, avšak pri jeho zahrievaní sa so zmenou teploty sa mení aj jeho pH – klesá (do kyslej oblasti), čo je práve nevýhodou Tris-ových roztokov. Na géli by sme teda po degradácii pozorovali dva proteíny s rozdielnou MW.

Čomu konkrétne pás s menšou MW zodpovedá by bolo možné posúdiť po analýze pásov, napr. ich sekvenovaním. Keďže sekvencia nášho pôvodného proteínu je známa, tak porovnaním by sa dalo zistiť, či tieto dva pásy zodpovedajú pôvodnému proteínu, alebo určitej skrátenej forme (a sekvenovanie by ukázalo, v ktorom mieste z N-konca nastalo prípadné štiepenie). Keďže oba pásy boli purifikovateľné, ak nastala degradácia, tak to bolo z N-konca proteínu, nie z C-konca (His-tag zostal zachovaný).

Ďakujem za super odpoveď. :)