Mitochondria je bunková organela, v ktorej prebieha životne dôležitý proces tvorby energie – oxidačná fosforylácia. Kyslík, ako jedna z kľúčových molekúl v tomto procese, je vysoko reaktívna molekula, zodpovedná za produkciu tzv. reaktívnych kyslíkových foriem (ROS, z angl. reactive oxygen species), ktoré môžu ireverzibilne poškodiť proteíny a ich funkciu v membráne mitochondrií. K týmto proteínom patria aj iónové kanály, ktorých porucha môže spôsobiť vážne poškodenie funkcie buniek alebo dokonca ich smrť [1]. Pre kardiomyocyty je nevyhnutné udržiavať kontinuálny prísun ATP a transmembránový potenciál vnútornej membrány mitochondrie [2]. V našej štúdii sme sa venovali výlučne iba mitochondriovým chloridovým kanálom srdcových buniek. Srdcia potkanov boli nastrihané na kašu a zhomogenizované. Pre získanie čistej frakcie submitochondriových vezikúl (SMP) sme použili diferenciálnu centrifugáciu v Percoll gradiente. Na zisťovanie jednokanálových (tzv. „single-channel“) charakteristík sme použili metódu inkorporácie iónových kanálov do planárnej lipidovej dvojvrstvy (BLM, z angl. bilayer/black lipid membrane). Redoxnú reguláciu týchto kanálov sme sledovali aplikovaním oxidovanej a redukovanej formy glutatiónu (GSH a GSSG) a ditiotreitolu (DTT), bežne používaného reduktanta disulfidových väzieb, na obe strany kanálu (tzv. cis a trans strana). Výsledky sme porovnali s článkom autorov Singh & Ashley z roku 2007, ktorí zistili, že rôzne pomery GSH:GSSG na cis strane kanálu nemali žiadny efekt, ale zvyšujúci sa pomer GSH:GSSG 2:1, resp. 1:1 v trans časti signifikatne znížil amlitúdu elektrického prúdu iónov prechádzajúcich cez kanál [3]. V našich experimentoch spomínané látky nemali žiaden vplyv na biofyzikálne charakteristiky kanálu ani v cis, ani v trans časti. DTT z cis strany nemalo žiadny efekt, ale koncentrácia 500 µmol/l z trans strany spôsobila zvýšenie reverzného potenciálu chloridového kanálu. Z trans oddielu pri pridaní DTT nemáme dostatok experimentov ani pridaných koncentrácií, teda navrhujeme v budúcnosti dôkladnejšie preskúmať vplyv DTT z trans strany. Zistili sme však, že chloridové kanály mitochondrií sú napäťovo závislé. S rastúcim kladným napätím sa zvýšila pravdepodobnosť otvorenia kanálu Popen.
Príspevok bol prezentovaný v rámci fakultného kola Študentskej vedeckej konferencie FMFI UK 2016. Práca bola podporená projektom VEGA/2/0146/16.
[1] Nishida, H., Matsumoto, A., Tomono, N., Hanakai, T., Harada, S. a Nakaya, H. Biochemistry and physiology of mitochondrial ion channels involved in cardioprotection. FEBS Letters. 2010, 584(10), 2161-2166.
[2] O'Rourke, B., Cortassa, S. a Aon, M.A. Mitochondrial ion channels: gatekeepers of life and death. Physiology (Bethesda). 2005, 20, 303-315.
[3] Singh, H. a Ashley, R.H. CLIC4 (p64H1) and its putative transmembrane domain form poorly selective, redox-regulated ion channels. Mol Membr Biol. 2007, 24(1), 41-52.
Záver a legenda grafov
Dobrý deň Janka, gratulujem k peknej práci a vhodne zostavenému posteru. K práci mám metodický komentár a jednu otázku, keďže Váš záver obsahuje konštatovanie zistených výsledkoch, ale nepok......úša sa o ich interpretáciu. Čím si vysvetľujete, že ste vo vašej štúdii „zistili, že aplikácia rôznych pomerov GSH:GSSG a reduktanta disulfidovej väzby
DTT nemala vplyv na biofyzikálne vlastnosti MitoCl kanálov.“? Pre doplnenie spôsobu interpretácie nesignifikantných záverov odporúčam pozrieť si komentár k práci Vašej kolegyne Ľudmily Valigurskej. V prípade, že výsledky diskutujete v rámci zmeranej skupiny vzoriek/zvierat/subjektov/experimentov, môžete smelo tvrdiť, „nebol efekt, nebol vplyv“. V prípade, že výsledky extrapolujete na celú študovanú populáciu, z ktorej ste „vyberali“ vzorky (čo je najčastejší zámer výskumníkov), pri nesignifikantnom výsledku nemôžeme tvrdiť, „nie je efekt, nie je vplyv“.
Ešte malá poznámka k legende obrázkov 3-5, kde uvádzate „ Hodnoty reverzného potenciálu (jednofaktorový ANOVA test, 95% konfidenčný interval, p = 0,92, stredné hodnoty ± SD, n = 4).“ atď. Zrejme ste chceli povedať, že ste globálny test ANOVA robili na hladine významnosti alfa=5%, ako by vyplývalo z Výsledkovej časti („Pre otestovanie rozdielu v hodnotách Popen medzi jednotlivými aplikovanými napätiami sme použili jednofaktorový ANOVA test (95% konfidenčný interval,...“). Lepšie je uviesť alfa, pretože čitateľ z legendy nemusí rozumieť, aké chybové úsečky sa v grafe uvádzajú. A je to dôležité, pretože sa od toho viaže interpretácia intervalu zobrazeného na grafe. Tu ide o interval priemer ± SD (štandardná odchýlka), ktorý sa viaže k variabilite samotných údajov – do akého intervalu padne s určitou pravdepodobnosťou nasledujúce meranie (v prípade jednonásobku SD so 68% pravdepodobnosťou). Na druhej strane 95% konfidenčný interval okolo priemeru vymedzuje oblasť, kde sa s 95% pravdepodobnosťou nachádza populačná hodnota priemeru (pre dané experimentálne podmienky), ktorý odhadujeme na základe našich meraní. Pre pripomenutie, 95% CI je približne dvojnásobok SEM (standard error of mean).
Čo sa týka výberu stĺpcových grafov, platí ten istý komentár, ako pre kolegyňu Valigurskú (a nepochybne rad ďalších, ktorých práce som ešte nepozrela :) Je to drobnosť, ale má význam pre skvalitnenie ďalších Vašich/vašich prác.
Prajem veľa úspechov. Iveta Waczulíková
Re: Záver a legenda grafov
Dobrý deň, ďakujem Vám veľmi pekne za Váš komentár a poznámky, určite ich v budúcnosti využijem. Rada by som sa vyjadrila k Vašej otázke: "čím si vysvetľujeme, že GSH:GSSG a DTT nemalo vplyv na biofyzikálne vlastnosti chloridových kanálov". My sme v našej práci vychádzali zo štúdie Singh a Ashley z roku 2007, ktorí skúmali purifikovaný proteín CLIC4 (Chloride Intracellular Channel 4). Mysleli sme si, že náš kanálový proteín môže byť totožný s týmto proteínom ale napokon sme zistili, že tieto dva proteíny pravdepodobne nebudú totožné. Nami merané vodivosti našich chloridových kanálov (100 - 120 pS) sa nezhodovali s vodivosťami CLIC4 proteínov, ktoré sme našli v odbornej literatúre (30 pS). Taktiež ani naše výsledky nekorešpondovali so štúdiou Singh a Ashley, ktorí zistili, že z trans strany zvyšujúci sa pomer GSH:GSSG znižoval amplitúdu prúdu iónov prechádzajúcich cez kanál. Navyše ďalšia štúdia zistila, že CLIC4 je predovšetkým proteín vonkajšej mitochondriovej membrány a nie vnútornej mitochondriovej membrány, z ktorej pochádzali naše submitochondriové vezikuly. Ide teda pravdepodobne o iný typ chloridových kanálov, ktoré nemusia byť redoxne regulované. Čo sa týka vplyvu DTT, vychádzali sme z odbornej literatúry a tak sme predpokladali, že v kanálovom proteíne sa nachádzajú disulfidové väzby. Po pridaní DTT by tak malo dôjsť k zmene štruktúry kanálového proteínu a zmene jeho vlastností, čo sa z cis strany nepotvrdilo a z trans strany nastala zmena reverzného potenciálu pri koncentrácii 500 umol/l, ale nemáme z trans strany dostatok experimentov ani pridaných koncentrácií, takže nemôžeme tvrdiť, že sa tam disulfidové väzby nachádzajú.
Tento poster bol použitý na prezentáciu výsledkov na ŠVK FMFI, kde som diskusiu bližšie nerozoberala. Čo sa týka záveru, bola použitá formulácia "nemalo vplyv", ale týka sa iba nami meraných chloridových kanálov izolovaných zo srdca potkana.
Ďakujem ešte raz za komentár, ak by ste mali akékoľvek ďalšie otázky, rada Vám ich zodpoviem. Jana Havlíková
Re: Re: Záver a legenda grafov
Ďakujem za profesionálnu odpoveď. Ad.interpretácie nesignifikantných nálezov, áno, neurobili ste interpretačnú chybu (aj keď ste si to pri písaní príspevku možno do detailov neuvedomovali), preto som napísala "môžete smelo tvrdiť" :) pretože ste formulačne nevyšli "za hranice" nálezu na vyšetrených vzorkách...pre výber sú nálezy a interpretácia "lokálneho efektu" perfektne platné. Avšak pre "populáciu" experimentov opakovaných (hocikým, hocikde) za rovnakých experimentálnych podmienok by ste museli formuláciu opraviť, pretože nesignifikantné výsledky o populačnom vplyve látok na charakteristiky kanálu na základe jedného testovania sú "inconclusive".
Pozdravujem,
iwa
Re: Re: Re: Záver a legenda grafov
Ďakujem pekne za Váš komentár. JH