Fosforylácia je postranslačná modifikácia modulujúca funkciu proteínu, ktorá je nevyhnutná pre bunkovú signalizáciu, proliferáciu, diferenciáciu a rast. Ide o dynamický proces, ktorého deregulácia spôsobuje množstvo chorobných procesov, vrátane rakoviny (1). Technológie založené na kvapalinovej chromatografii, ktorá je spojená s hmotnostnou spektrometriou (MS) predstavujú efektívny nástroj na identifikáciu proteínov a ich postranslačných modifikácií. Pretože fosforylované peptidy sa nachádzajú v komplexných vzorkách v oveľa menšom zastúpení, v porovnaní s ich nemodifikovanými formami, je nutné, aby pracovný postup obsahoval krok zabezpečujúci obohatenie fosforylovaných peptidov (2). Nevyhnutnou prípravy vzoriek je aj frakcionácia, ktorá významne znižuje komplexnosť vzoriek a tým zvyšuje množstvo identifikovaných fosforylačných miest.
Nedávno optimalizovaný pracovný postup z nášho laboratória zahŕňa extrakciu proteínov, enzymatické štiepenie proteínov na peptidy a extrakciu na reverznej fáze. Nasledujú kroky typické pre prípravu fosfoproteomických vzoriek, konkrétne obohatenie fosfopeptidov pomocou afinitnej chromatografie s imobilizovaným kovom (IMAC) a frakcionácia pomocou silnej anión-výmennej (SAX) a poréznej grafitovej (PGC) chromatografie. Na MS analýzu sa používa kvapalinová chromatografia nanoflow Ultimate HPLC spojená s hmotnostným spektrometrom Orbitrap. Na spracovanie a bioinformatickú analýzu MS dát sa využívajú softvérové nástroje MaxQuant a Perseus (3).
Takýmto spôsobom boli analyzované dve skupiny vzoriek, ktoré sa líšili použitou frakcionačnou technikou, PGC resp. SAX. Rozdiely medzi vzorkami boli skúmané na úrovní proteínových skupín, ako aj fosforylačných miest. Z našich zistení vyplýva, že pomocou rôznych techník sú vzorky obohacované o rozličné fosfopeptidy. Preto kombináciou rôznych frakcionačných metód je možné dosiahnuť významné zvýšenie množstva identifikovaných fosforylačných miest. Použitím vyššie uvedeného spôsobu prípravy vzoriek a následnej analýzy pomocou hmotnostnej spektrometrie sme boli schopní identifikovať 1274 nových, doposiaľ neanotovaných fosforylačných miest, ktoré môžu byť prínosné pre pochopenie regulácie bunkových procesov.
Táto práca vznikla vďaka podpore Agentúry na podporu výskumu a vývoja, v rámci projektu č. APVV-16-0120, VEGA grantov 2/0026/18 a 2/0039/19, a Slovenskej akadémie vied, v rámci programu pre doktorandov č. APP0007. Na podpore projektu sa ďalej podieľal Operačný program Integrovaná infraštruktúra pre projekt: Centrum pre biomedicínsky výskum – BIOMEDIRES – II. etapa, kód ITMS: 313011W428, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.
replikat vs. vzorka
Dobry den Dr. Sivakova,
chcel by som poprosit, viete upresnit nasledovne: ...biologické replikáty pripravené rovnakou frakcionačnou
technikou korelovali významnejšie, ako vzorky pripravené v rovnakom čase. Pre zaujimavost by som sa chcel opytat, ake je asi mnozstvo fosforylovanych proteinov a pocet fosforylacii na nich - v porovnani s "nefosforylovanymi?" Este posledna otazka, fosf. je dynamicka, fosfoproteom teda bude aj funciou zivotneho cyklu/prostredia atd. organizmu, alebo sa meni len relativne zastupenie jednotlivych fosforylacii?
Dakujem, PF
Re: replikat vs. vzorka
Dobrý deň dr. Farkaš,
mieru korelácie možno odčítať z bodového grafu. Ak si napr. vyberieme biologický replikát S1 vzorky pripravenej PGC a SAX, hodnota sa rovná 0,711. No ak si porovnáme replikáty S1 a S2 pripravené rovnakou technikou (PGC) hodnota korelácie je 0,907. Kombináciou dvoch rozličných techník sa nám podarilo identifikovať 1984 fosforylovaných proteínových skupín a 8353 fosforylačných miest, súčasne aj 1155 nefosforylovaných skupín. Fosforylácia sa dynamicky mení, a to najmä kvôli pôsobeniu kináz a fosfatáz. Počas bunkového cyklu, signalizácie a pod. možno túto zmenu pozorovať ako na úrovni proteínov, tak aj na relatívnom zastúpení jednotlivých fosforylácií, nakoľko sa proteíny v bunkách nachádzajú vo viacerých kópiách.
Ďakujem
Siváková
Re: Re: replikat vs. vzorka
Dakujem za odpoved a zelam vela zdaru! :-)
IP-vzorky
Dobry den,
ako clovek neznaly techniky by som sa chcela opytat, ze keby som potrebovala identifikovat fosfo-miesta na proteine, ktory v malom mnozstve vytiahnem z nadorovych buniek imunoprecipitaciou, ci by taketo obohatenie o fosfopeptidy zvysilo sance na identifikaciu pripadnych fosfo-miest imunoprecipitovaneho proteinu. Dakujem a drzim palce v dalsom vyskume! :)
Re: IP-vzorky
Dobrý deň,
myslím si, že áno, aj keď v takomto prípade by som asi volila iný spôsob obohatenia, napr. na malých kolónkach s oxidom titaničitým. Ďakujem
Siváková
Re: Re: IP-vzorky
Dakujem za velmi pekne za odpoved. :)