Opakované využitie kremičitanovej matrice pre zvýšenie výťažku plazmidovej DNA

Úvod: izolačné techniky nukleových kyselín s využitím kremičitanových matríc predstavujú efektívny nástroj na získanie čistých vzoriek DNA. Limitujúcim faktorom však môže byť množstvo komerčných kolóniek s kremičitanovou matricou, ktoré sa používajú pri izolácii plazmidu záujmu. Štandardná minikolóna má kapacitu viazať na svoj povrch až 20 µg DNA [1]. Opakované využitie kremičitanovej matrice pri izolácii nukleových kyselín znižuje náklady laboratória pri práci s DNA a znižuje množstvo vygenerovaného odpadu. Avšak pri izolácii rôznych vzoriek DNA rovnakou minikolónou existuje riziko kontaminácie. Kyselina chlorovodíková efektívne degraduje zvyšky nukleovej kyseliny a eliminuje riziko kontaminácie DNA bez signifikantného vplyvu na schopnosť kremičitanovej kolóny viazať nukleové kyseliny [2]. Cieľom práce je porovnať rôzne prístupy k izolácii nukleových kyselín s použitím minikolóny, konkrétne vplyv predizolácie plazmidovej DNA na kvantitu prečistenej DNA a možnosť opakovaného využitia minikolóny.

Materiál a metódy: plazmidy boli izolované z 20 ml nočnej kultúry Escherichia coli DH5α. Konkrétne boli izolované plazmidy pET28a-RT-wt s veľkosťou 7387 bp, pJexpress404-RT-wt s veľkosťou 6033 bp a pUC57-RT-wt s veľkosťou 4717 bp. Pri izolácii plazmidov sme použili metódu alkalickej denaturácie, ktorá slúžila ako predizolačný krok pred využitím kolónkovej izolácie. Následne sme použili súpravu QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen), riadili sme sa pokynmi od výrobcu.

Výsledky a diskusia: pomocou piatich kremičitanových kolóniek sme izolovali 51,9 µg pET28a-RT wt, 47,7 µg pJexpress404-RT-wt a 41,2 µg pUC57-RT-wt. Množstvá pDNA v elučných frakciách nedosahujú 20 µg DNA, čo je možné vysvetliť napríklad rozdelením nanášaného roztoku na viacero vzoriek, čím sme nariedili množstvo DNA na kolónke. Elučný objem taktiež zohráva dôležitú úlohu, nakoľko pri znižovaní objemu môže dôjsť k neúplnému uvoľneniu DNA z kolónky. Zvyšovanie objemu elučného roztoku môže znížiť výslednú koncentráciu DNA, avšak môže zvýšiť celkový výťažok v elučnej frakcii. Pri izolácii plazmidu z 20 ml nočnej kultúry je vhodné vykonať predizoláciu a rozdeliť výslednú vzorku minimálne 4-krát pre získanie vyššieho výťažku pDNA. 

Záver: Izolovali sme pET28a-RT-wt, pJexpress404-RT-wt, pUC57-RT-wt v postačujúcej kvantite a kvalite na ďalšie aplikácie ako sekvenovanie, transformácia buniek, cielená mutagenéza, subklonovanie a iné. V budúcnosti plánujeme porovnať výťažok pri zvyšovaní objemu elučného roztoku a vykonať PCR na prítomnosť kontaminácií v elučnej frakcii, získanej pomocou viacnásobne využitej minikolóny po pôsobení kyseliny chlorovodíkovej.