FFPE (formalin-fixed, paraffin-embedded) DNA má svoje obmedzenia pre testovanie mutácii, pretože fixácia formalínom a zaliatie do parafínu, podmienky skladovania a doba skladovania spôsobia fragmentáciu DNA a chemické modifikácie molekúl. Avšak deaminácia cytozínových báz na deoxyuracil komplikuje sekvenovanie DNA pomocou aj Sangerovej metódy, aj pri sekvenovaní druhej generácie. Izolácia DNA z FFPE tkaniva a jej následné použitie je spojené s niekoľkými zmenami. Jedným z hlavných problémov súvisiacich s FFPE DNA je výskyt sekvenačných artefaktov, čo predstavuje zjavné sekvenačné zmeny, ktoré nie sú prítomné v pôvodnom templáte. Tieto zmeny vedú k C–T prestavbe v sekvenačných reakciách. Medzi sekvenačnými artefaktmi zistenými v FFPE DNA sú premeny C:G>T:A variantov najčastejším typom SNV (Single Nucleotide Variant). Také artefakčné C:G>T:A varianty môžu byť výrazne znížené po opracovaní FFPE DNA s enzýmom UDG (Uracil-DNA Glycosylase) pred PCR amplifikáciou, čo naznačuje, že uracilové lézie sú hlavným zdrojom artefakčných C:G>T:A variantov v FFPE DNA. UDG môže špecificky odstrániť deaminované cytozínové bázy z DNA získanej z FFPE vzorky. Ukázalo sa, že úspešnosť amplifikácie DNA z FFPE tkanív, v porovnaní s „čerstvou“ DNA, sa výrazne zníži. Na analýzu bola použitá krv obidvoch rodičov a na získanie DNA z plodu bol k dispozícii FFPE materiál z potrateného plodu, pričom vek tkaniva v čase izolácie DNA bol 23 mesiacov. Pomocou sekvenovania druhej generácie sa ukázalo, že obaja rodičia boli heterozygoti pre deléciu v CC2D2A géne, avšak táto metóda nebola účinná pre FFPE vzorku. Po opracovaní UDG, DNA extrahovaná z FFPE vzorky je účinná na testovanie mutácii použitím Sangerovho sekvenovania. Zistilo sa, že plod bol homozygotom pre deléciu v CC2D2A géne. Pomocou sekvenovania druhej generácie a Sangerovho sekvenovania sa podarilo odhaliť príčinu daného potratu. Ukázalo sa, že obaja rodičia boli heterozygoti pre deléciu v géne CC2D2A a plod bol homozygot pre deléciu v tom istom CC2D2A géne, ktorý je asociovaný s Meckel-Gruber syndrómom.
[1] Yokota T., Shibata N., Ura T., et al. (2010) Transl. Res. 156(2), p. 98.
[2] Kavli B., Otterlei M., Slupphaug G., et al. (2007) DNA Repair. 6(4), p. 505.
[3] Do H., Dobrovic A. (2012) Oncotarget. 3(5), p. 546.
[4] Sah S., Chen L., Houghton J., et al. (2013) Genome Med. 5(8), p. 77.
[5] Ludyga N., Grunwald B., Azimzadeh O., et al. (2012) Virchows Arch. 460(2), p. 131.
[6] Didelot A., Kotsopoulos S., Lupo A, et al. (2013) Clin. Chem. 59(5), p.815.
Kit
Dobrý deň, veľmi pekná práca. Chcela by som sa opýtať, že či by sa dala izolovať DNA aj iným spôsobim ako cez kit? Ďakujem
Re: Kit
Dobrý deň, DNA z FFPE by sa mala dať izolovať aj iným spôsobom ako cez kit, no my sme to neskúšali. Naopak, skúšali sme izoláciu s použitím rôznych iných kitov/protokolov, no GeneRead DNA FFPE Kit (Qiagen, Hilden, Germany) sa ukázal ako najlepší, nakoľko obsahoval enzým UDG.