Úvod: Syndróm diabetickej nohy je jednou z najčastejších chronických komplikácií diabetes mellitus a prejavuje sa diabetickými vredmi, ktorých hojenie často komplikujú infekcie spôsobené multirezistentnými baktériami. Antibiotická liečba infikovaných vredov je komplikovaná vzhľadom na trend zvyšujúcej sa rezistencie baktérií a ich biofilmov voči tomuto typu terapie. Do skupiny obávaných multirezistentných baktérií označovanej akronymom ESKAPE patrí aj Klebsiella spp. V súčasnosti je preto potrebný vývoj nových prístupov k liečbe bakteriálnych infekcií [1, 2]. Fágová terapia predstavuje sľubný alternatívny alebo doplnkový prístup k antibiotickej terapii, pretože fágy majú oproti antibiotikám viacero výhod. Medzi najdôležitejšie patrí presné zacielenie liečby na dané patogény a zabránenie vzniku bakteriálnej rezistencie. Pred použitím v terapii musia byť bakteriofágy purifikované a dobre charakterizované, aby sa zabezpečila ich najvyššia bezpečnosť a účinnosť [3].

Ciele: Cieľom práce bola izolácia nových lytických bakteriofágov z odpadových vôd, ktoré infikujú kmene Klebsiella pneumoniae a Klebsiella oxytoca získané z vredov diabetickej nohy, s následnou purifikáciou a fenotypovou aj genomickou charakterizáciou týchto fágov za účelom ich potenciálneho využitia vo fágovej terapii.

Metodika: Počas experimentov sme používali metódy izolácie bakteriofágov z odpadovej vody, amplifikácie fágov a stanovenia fágového titra na dvojitom agare. Purifikáciu fágov sme dosiahli viacnásobným odpichnutím jednotlivých plakov z dvojitého agaru, zrážaním bakteriofágov polyetylénglykolom a ultracentrifugáciou fágov v hustotnom gradiente CsCl s následnou dialýzou. Purifikované fágy sme použili na stanovenie hostiteľskej špecificity, teplotnej stability a adsorpcie bakteriofágov. Určili sme optimálnu multiplicitu infekcie (MOI), životný cyklus a antimikrobiálnu aktivitu fágov v tekutom živnom médiu. Pri charakterizácii fágov sme izolovali fágovú DNA pomocou Phage DNA Isolation Kit (Norgen Biotek Corp., Kanada). Purifikované DNA sme sekvenovali pomocou prístroja MiSeq (Illumina, USA) s použitím v2 300 cyklovej chémie a Nextera XT protokolu na prípravu knižnice krátkych čítaní. Celogenómové sekvencie sme použili na taxonomické zaradenie fágov a anotáciu ich genómov.

Výsledky: Z ČOV sme izolovali 3 bakteriofágy, ktoré sme purifikovali v hustotnom gradiente CsCl. Najširšie spektrum hostiteľov mal fág vB_Kox_VP25, ktorý lyzoval 20,55 % zo 73 testovaných kmeňov. Všetky fágy infikovali kmene Klebsiella spp. a Cronobacter spp. Najvyššiu mieru adsorpcie počas 10 min. preukázal fág vB_Kpn_VP23 (98,06 %). Teplotne najstabilnejší pri 37 °C bol fág vB_Kox_VP24, pri 70 °C fág vB_Kox_VP25. Najdlhší životný cyklus mal fág vB_Kpn_VP23, najkratší fág vB_Kox_VP24 a najviac častíc na bunku produkoval fág vB_Kox_VP25. Najvyššiu antimikrobiálnu aktivitu in vitro preukázal fág vB_Kox_VP25, pričom z pôvodnej bakteriálnej populácie prežívalo po 6 hod. len 4,03 – 14,70 % buniek. Prístupmi NGS sme získali celogenómové sekvencie fágov, ktoré sme anotovali a vytvorili fylogenetický strom príbuznosti. Najbližší príbuzný k vB_Kpn_VP23 bol Klebsiella fág KP36 (Webervirus), v prípade vB_Kox_VP24 a vB_Kox_VP25 to bol Klebsiella fág VLCpiA1g (Drulisvirus).

Záver: Fág vB_Kpn_VP23 má potenciál byť temperovaný, a preto nie vhodný pre fágovú terapiu. Najlepšie vlastnosti preukázal fág vB_Kox_VP25 a spolu s vB_Kox_VP24 majú potenciálne terapeutické využitie.