Terapeutické monoklonálne protilátky (mAbs) sú imunoglobulíny typu IgG1 alebo IgG4, ktoré sa využívajú ako biofarmaká vykazujúce vysoko selektívnu väzbu na špecifické antigény alebo epitópy. MAbs sa využívajú na terapiu mnohých ochorení ako napríklad nádorových ochorení, autoimunitných ochorení, či vírusových infekcií [Alejandra et al., 2023]. V posledných rokoch došlo k expanzii produkcie terapeutických mAbs. Aktuálne Food and Drug Administration (FDA) registruje 125 mAbs schválených na liečbu, zatiaľ čo Európska lieková agentúra (EMA) 112 mAbs [The Antibody Society, 2024]. Najčastejšou metódou využívanou pre stanovenie mAbs je enzýmová imunosorbentná analýza (angl. ELISA). Niektoré nevýhody ELISA testu viedli k rozvoju chromatografických techník spoločne s hmotnostnou spektrometriou (MS) pre kvantitatívne analýzy mAbs. Kvapalinová chromatografia (LC) MS využíva najčastejšie tzv. „bottom-up“ metódu, kde je mAb enzymaticky natrávená na menšie peptidy. Táto práca je zameraná na využitie metódy s jednoduchšou prípravou vzorky, tzv. „middle-up“ metódy stanovenia mAbs, kde je mAb redukovaná na menšie proteínové podjednotky, v spojení s kapilárnou elektroforézou (CE). CE má mnohé výhody ako vysoká separačná účinnosť, absencia stacionárnej fázy a nízka spotreba chemikálií a vzorky, ktoré sú v kombinácii s MS ideálne na analýzu proteínov [Tomasovsky et al., 2023]. Zásobný roztok 1 mg/mL referenčného štandardu infliximabu (IFX) (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, US) bol redukovaný činidlom tris(2-carboxyetyl)fosfín (TCEP). IFX bol po pridaní TCEP inkubovaný pri 37 °C po dobu 1 hodiny. Pre CE analýzu redukovanej mAb bola použitá nepokrytá kremenná kapilára (83 cm, i.d. 50 μm). Pre optimalizáciu vodiaceho elektrolytu (BGE) boli testované rôzne koncentrácie kyseliny mravčej a octovej. Separačné napätia boli testované v rozmedzí 18–25 kV. MS analýza bola vykonaná v skenovacom režime a SIM režime. Získané predbežné výsledky ukazujú, že optimálny BGE je 1 M kyselina mravčia pri optimalizovanom separačnom napätí 25 kV. Pri týchto podmienkach bola dosiahnutá aj separácia ľahkých a ťažkých IFX reťazcov. Následne sme validovali metódu CE-MS. S optimalizovanými parametrami boli získané aj ďalšie dáta, ktoré boli spracované pre stanovenie obsahu IFX vo farmaceutickej matrici (liečivo Remicade).
Práca bola vykonaná v TAC FaFUK. Projekt bol podporený VEGA 1/0514/22 a VEGA 1/0483/20.
[The Antibody Society, 2024] “Antibody therapeutics approved or in regulatory review in the EU or US,” The Antibody Society. Accessed: Mar. 27, 2024. [Online]. Available: https://www.antibodysociety.org/resources/approved-antibodies/
[Alejandra et al., 2023] “Production of monoclonal antibodies for therapeutic purposes: A review,” International Immunopharmacology, vol. 120, p. 110376.
[Tomasovsky et al., 2023] “Capillary electrophoresis on‐line hyphenated with mass spectrometry for analysis of insulin‐like growth factor‐1 in pharmaceutical preparations,” Electrophoresis, p. elps.202300089.
Limity detekcie
Limity detekcie
Gratulujem k peknej práci. V závere píšete, že z validácie výsledkov je jasné, že CE-MS dosahuje dostatočnú presnosť a správnosť až pre vysoké koncentrácie monoklonálnych protilátok. Existuje tu priestor pre vylepšenie metódy tak, aby poskytovala validné výsledky aj pre nižšie/nízke koncentrácie mAbs? Ďakujem a držím palce k obhajobe bakalárskej práce.
iwa
Dobrý deň,
Dobrý deň,
samozrejme zlepšenie by bolo ideálne. Predpokladáme, že nepresnosť vzniknutá pri nízkych koncentráciach, bola spôsobená nepoužitím interného štandardu, taktiež pri tvorbe kalibračné krivky sa ťažko určoval rozdiel medzi šumom a signálom vzorky. Zlepšenie by mohlo nastať pri použití viacerých vzorových koncentrácii pri tvorení kalibračné krivky.
Ďakujem za odpoveď a prajem
Ďakujem za odpoveď a prajem veľa úspechov vo Vašej ďalšej práci.
iwa