Úvod: Cyklodextrín glykozyltransferázy (CGTázy) sú enzýmy schopné produkovať cyklodextríny z polysacharidov. Cyklodextríny sú cyklické oligosacharidy vytvorené spojením 6 až 8 glukózových zvyškov do prstenca. Poznáme 3 základné typy cyklodextrínov, a to α-CD, β-CD a γ-CD so 6, 7 a 8 glukózovými jednotkami. Všetky typy sú nehygroskopické kryštalické látky [1]. Cieľom práce bolo zvýšiť výťažok expresie termostabilnej cyklodextrín glykozyltransferázy izolovenej z Thermoanaerobacter sp. [2].
Materiál a metódy: Bakteriálny kmeň: BL21(DE3)pLysS s plazmidom pET28a (kanamycínová rezistencia), ktorý má inzertovaný gén pre CGTázu. Maloobjemová expresia v Erlenmayerových bankách prebiehala v LB médiu pri rôznych teplotách (37, 28, 20 °C) 4 hodiny od indukcie. Bunky sme homogenizovali ultrazvukovým homogenizátorom. Získané vzorky sme analyzovali pomocou SDS-PAGE.
Výsledky a diskusia: Počas produkcie sme analyzovali vplyv teploty na expresiu. Na základe denzitometrie sme stanovili priemerný výťažok proteínu počas jednotlivých hodín exprimovania. Najvyšší výťažok sme dosiahli pri 28 °C po 4 hodinách expresie. Výsledky sú podobné publikovaným štúdiám, ktoré pozorovali najlepšie výsledky v rozmedzí teplôt 25 – 30 °C [3, 4]. Expresia pri 37 °C spôsobila pokles cieľového proteínu.
Záver: Pomocou expresie v Erlenmayerových bankách sa nám podarilo vyprodukovať najvyššie množstvo CGTázy pri teplote 28 °C v bunkách BL21(DE3)pLysS v LB médiu.
Príspevok je výsledkom realizácie projektov APVV-22-0161 (Využitie biotechnologickych transformácií pri výrobe zdraviu prospešných nápojov), APVV-17-0333 (Výskum a vývoj efektívnych procesov prípravy vanilínu a iných prírodných aróm s využitím oxidačného a protektívneho účinku rekombinantnej katalázy a peroxidázy) a APVV-20-0284 (Hybridné hémové peroxidázy húb z pralesa s využitím v environmentálnych biotechnológiách).
[1] Řezanka M. (2007) Syntéza monosubstituovaných derivátů cyklodextrinů. (Diplomová práca) Univerzita Karlova v Praze.
[2] Jørgensen, S., Tangney, M., Starnes, R. et al. (1997) Biotechnol. Lett. 19, p. 1027–1031.
[3] Zheng, J., Li, X., & Wu, H. (2019) 3 Biotech, 9, p. 1-11.
[4] Cheng, J., Wu, D., Chen, S., Chen, J., & Wu, J. (2011) J. Agric. Food Chem., 59, p. 3797-3802.