Bakteriofágy ako intracelulárne parazity na svoju replikáciu a proliferáciu vyžadujú prítomnosť bakteriálnych buniek. V priebehu evolúcie si bakteriofágy vyvinuli viaceré mechanizmy na zvýšenie účinnosti infekcie v podobe rozpoznávania rôznych druhov receptorov na bakteriálnom povrchu. Na tento účel bakteriofágy využívajú predovšetkým chvostíkové proteíny, ktoré obsahujú rôzne receptor-viažuce domény ako aj domény degradujúce peptidoglykán [1, 2]. Hlavný chvostíkový proteín bakteriofága BFK20 – gp15 (kodovaný génom orf15) vo svojej štruktúre obsahuje prítomné dve proteínové domény: TMP (z angl. tape measure protein) a SLT doménu (z angl. soluble lytic transglycosylase). TMP doména slúži ako determinant dĺžky fágového chvostíka počas jeho maturácie [3]. SLT domény sa vyskytujú predovšetkým ako súčasť bakteriálnych enzýmov, ktoré sa podieľajú na metabolizme bunkovej steny počas rastu a delenia buniek, kde je potrebná čiastočná degradácia bunkovej steny [4]. Lokálna degradácia peptidoglykánu umožňuje bakteriofágom účinnejšie infikovať bakteriálne bunky, ako napr. v prípade nepriaznivých podmienok spôsobených zmenami v štruktúre bakteriálnej bunkovej steny [5]. Pochopenie mechanizmu infekcie bakteriálnych buniek bakteriofágom je nevyhnutné pre rozvoj poznatkov a nových prístupov využívajúcich degradačné vlastnosti bakteriofágmi-kódovaných proteínov. Našim cieľom bolo štúdium vzťahu medzi sekvenčnými úsekmi SLT proteínov a fyziologicko-štruktúrnymi vlastnosťami pripravených rekombinantných proteínov. V jednotlivých analýzach sme porovnávali predikované SLT proteíny SLT02 (14,2 kDa) a SLT05 (16,7 kDa) odlišujúce sa dĺžkou 25 aminokyselín v oblasti priľahlej k SLT doméne. Pomocou bioinformatických prístupov sme identifikovali prítomnosť aminokyselinového motívu ES – GLMQ, charakteristického pre enzýmy degradujúce peptidoglykán. Analyzovali sme schopnosť rekombinantných SLT proteínov vytvárať oligomérne štruktúry v prítomnosti činidla glutaraldehyd a aj v prítomnosti kofaktorov kovových prvkov. Pozorovali vznik dimérnych a oligomérnych jednotiek, na základe čoho sme usúdili, že prídavok kofaktorov mal vplyv na vznik väčšieho počtu oligomérnych jednotiek. Pomocou metódy nanoDSF (nanoscale differential scanning fluorimetry) sme zisťovali termálnu stabilitu SLT proteínov. Stabilita je dôležitá pre zaistenie optimálnych podmienok pre biologické fungovanie proteínov. SLT05 dosahoval nižšie hodnoty teploty topenia v porovnaní s proteínom SLT02 vo všetkých testovaných podmienkach. Najvhodnejší tlmivý roztok z hľadiska stability predstavuje pre oba SLT proteíny kyselina jantárová (pH 5,4), kde SLT02 dosahuje teplotu topenia Tm= 47,6 °C a SLT05 Tm= 45,5 °C. Zároveň sme analyzovali vplyv prídavných látok – CaCl2, MgCl2 a ZnCl2 na stabilitu proteínov. Prítomnosť kofaktorov Ca2+ a Mg2+ nemá zatiaľ preukázateľný pozitívny vplyv, avšak prítomnosť Zn2+ výrazne znižuje stabilitu SLT proteínov a dochádza k formovaniu proteínových agregátov.
Predložená práca bola financovaná z projektu VEGA 2/0079/22: Príprava mutantných lytických a replikačných proteínov bakteriofágov a ich antibakteriálny potenciál.
[1] Santos, S. B., Cunha, A. P., Macedo, M., Nogueira, C. L., Brandão, A., Costa, S. P., Melo, L. D. R., Azeredo, J., & Carvalho, C. M. (2020). Bacteriophage-receptor binding proteins for multiplex detection of Staphylococcus and Enterococcus in blood. Biotechnol. Bioeng, 117(11).
[2] Swanson, N. A., Lokareddy, R. K., Li, F., Hou, C. D., Leptihn, S., Pavlenok, M., Niederweis, M., Pumroy, R. A., Moiseenkova-Bell, V. Y., & Cingolani, G. (2021). Cryo-EM structure of the periplasmic tunnel of T7 DNA-ejectosome at 2.7 Å resolution. Mol. cell, 81(15), 3145–3159.e7.
[3] Bukovska, G., Klucar, L., Vlcek, C., Adamovic, J., Turna, J., & Timko, J. (2006). Complete nucleotide sequence and genome analysis of bacteriophage BFK20--a lytic phage of the industrial producer Brevibacterium flavum. Virol., 348(1), 57–71.
[4] Scheurwater, E., Reid, C. W., & Clarke, A. J. (2008). Lytic transglycosylases: bacterial space-making autolysins. Int. J. Biochem. Cell. Biol. , 40(4), 586–591.
[5] Moak, M., & Molineux, I. J. (2004). Peptidoglycan hydrolytic activities associated with bacteriophage virions. Mol. Microbiol., 51(4), 1169–1183.