Candida utilis je klasifikovaná ako GRAS mikroorganizmus od FDA. Výhodné vlastnosti tejto kvasinky sú rýchly rast, jednoduchá genetická modifikácia, posttranslačná modifikácia proteínov, vylučovanie rekombinantných proteínov do kultivačného média a jej sekretóm neobsahuje proteolytické enzýmy, ktoré by mohli spôsobiť nežiadúcu degradáciu produktu. Enterokináza je serínová proteáza, ktorá po štiepení N-terminálneho peptidu v sekvencii DDDDK nezanecháva aminokyselinové zvyšky na rekombinantnom proteíne. Ecarin je zložkou jedu hada nazývaného Echis carinatus a tak isto ako enterokináza, je schopný štiepiť fúzne proteíny v sekvencii DGR, čo sa využíva pri purifikácii cieľových proteínov. Cieľom práce bolo optimalizovať využitie kodónov v sekvencii enterokinázy a ecarinu pre kvasinku C. utilis, a overiť vplyv prítomnosti prirodzených rozoznávacích sekvencií pre proteázy Kex2 a Ste13 a umelých, ktoré rozpoznávajú ecarin a enterokinázu na procesovanie sekrečného signálu a ich aktivitu.
Tento projekt bol pripravený na základe projektu „Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov“ (BIOREKPROT – ITMS: 26240220048) financovaných zo zdrojov ERDF a vďaka projektu APVV-17-0149.
[1] Boze H., Moulin G., Galzy P. (1992) Rev. Biotechnol. 12, p. 65
[2] Buerth C., Heilmann C. J., Klis F. M., et al. (2011) Microbiol. 157, p. 2493
[3] Zhang A. L., Luo C. X., Zhang, C. Y., et. al (2008) Mol. Biol. Rep. 36, p. 1611
[4] Yi J. H., Zhang Y. X. (2006) Chin. J. Biotechnol. 22(5), p. 811
[5] Bertina R. M., Van Der Marel-Van Nieuwkoop W., Loeliger E. A. (1979) Thromb. Haemos. 42, p. 1296
prakticka aplikacia
Dobry den, velmi sofistikovana praca, blahozelam k vysledkom. Mna by zaujimalo prakticke vyuzitie vami pripravenych plazmidov. Uvadzate, ze experiemnty boli sucastou vacsieho projektu „Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov“ teda by ma zaujimal aplikacny potencial smerom do praxe. Vopred dakujem za odpoved, ZB
Re: prakticka aplikacia
Dobrý deň, ďakujem za otázku. Plazmidy sú pripravované na maloobjemovú produkciu ľahkého reťazca ľudskej enterokinázy (EK) a ekarinu (EC). Nakoľko sme mali v minulosti dobré skúsenosti s produkciou ľahkého reťazca ľudskej enterokinázy v kvasinke Pichia pastoris, tak sme sa vydali cestou lepšieho producenta a tým by mala byť kvasinka Candida utilis, vďaka jej výhodným vlastnostiam ako je sekrécia proteínov do média a jej sekretóm neobsahuje proteolytické enzými. Potenciálom do praxe pre EK a EC je štiepenie fúznych partnerov. Fúzny partner môže napomáhať pri produkcii proteínu ale pri následnej purifikácii je už nežiadúci a preto ho treba odstrániť. Keďže EK a EC štiepia proteíny v presnej kanonickej sekvencii bez zanechania aminokyselinových zvyškov, sú tieto proteázy ideálnym nástrojom na štiepenie rekombinantne produkovaných fúznych proteínov. Do budúcnosti sa plánuje mutagenéza s cieľom zvýšiť afinitu enzým-substrát. A keďže EC je metaloproteáza, chceli by sme zistiť podmienky ako by sa dala inaktivovať v presnom momente, čím by sa mohlo zamedziť nešpecifickej aktivite.