Charakterizácia modelu replikačnej senescencie In vitro

V dnešnej dobe spoločnosť čelí fenoménu predlžovania dĺžky života, ktorý je spojený najmä s rozvojom modernej spoločnosti, ako aj s pokrokom v liečbe mnohých patológií. Podľa odhadov Svetovej zdravotníckej organizácie v roku 2050 počet ľudí starších ako 60 rokov presiahne 20 % svetovej populácie ¹. Na druhej strane starnutie samé o sebe je rizikovým faktorom pre rozvoj ochorení ako sú rakovina, neurodegeneratívne ochorenia a diabetes mellitus. Proces starnutia je spojený s chronickým oxidačným stresom všetkých buniek organizmu. Pretrvávajúce porušenie redoxnej homeostázy má ďalekosiahly vplyv na funkčnosť mitochondrií a lyzozómov, na katabolické, ako aj anabolické procesy či expresiu mnohých génov a stabilitu DNA. V dôsledku týchto faktorov bunka vstupuje do stavu tzv. senescencie, primárne charakterizovanej stratou delenia a rôznymi fenotypickými zmenami, ako jedného zo znakov starnutia. Funkcia a úloha senescentných buniek je stále predmetom výskumu a esenciálnej snahy o porozumenie procesu starnutia. K prioritným cieľom tejto oblasti výskumu patrí objasnenie zmien v redoxnej a proteínovej homeostáze počas starnutia bunky a možností modulácie týchto procesov ².

Replikačná senescencia ľudských fibroblastov in vitro predstavuje často používaný model starnutia. Je sprevádzaná stratou proliferačnej kapacity, zástavou bunkového cyklu v niektorej z jeho fáz, stratou responsivity na mitogénnu signalizáciu a ďalšími dramatickými zmenami týkajúcimi sa bunkovej morfológie, génovej expresie, epigenetiky a metabolizmu. K hlavným mechanizmom navodzujúcim senescenciu patrí skracovanie telomér, DNA-proteínových komplexov na konci chromozómov ³.

Cieľom našej práce bolo zaviesť a charakterizovať model replikačnej senescencie s použitím primárnych ľudských fibroblastov VH-10. Tento in vitro model má neskôr slúžiť ako vhodný celulárny testovací systém pre štúdium modulácie procesov sprevádzajúcich starnutie pomocou látok prírodného a syntetického pôvodu.

V bunkách neskorých pasáží (105 - 140 DIV) došlo k signifikantnému nárastu markerov senescencie, ako sú aktivita β-galaktozidázy spriahnutej so senescenciou či k nárastu autofluorescencie zodpovedajúcej lyzozomálnej akumulácii lipofuscínu, tzv. „pigmentu starnutia“. Ďalej sme pozorovali zvýšené hladiny intracelulárnych reaktívnych foriem kyslíka v bunkách, čo môže súvisieť so zmenami mitochondriálnej aktivity. Ďalším znakom senescentých buniek je znížená konverzia LC3 proteínu, čo spolu s hromadiacim sa lipofuscínom poukazuje na zhoršenie toku autofágie. V senescentých bunkách došlo k zníženiu proliferačnej kapacity a k blokácii bunkového cyklu v G2/M. Taktiež sme  pozorovali nárast hladín proteínov p53 a p21 v závislosti od dĺžky kultivácie senescentných buniek. Z uvedených výsledkov vyplýva, že daný model poskytuje širokú škálu parametrov spojených s replikačnou senescenciou a  je vhodný pre štúdium mechanizmov starnutia.