Úvod: Astrocyty sú gliové bunky, ktoré majú v mozgu rozličné funkcie: slúžia na transport metabolitov od a k neurónom, regulujú vychytávanie neuroprenášačov a ich inaktiváciu, sú zodpovedné za vznik gliálnej jazvy v poranených častiach mozgu, a ako jediný bunkový typ v centrálnom nervovom systéme (CNS) sú schopné ukladať glykogén. Ich najdôležitejšou úlohou však je udržiavanie homeostázy extracelulárneho priestoru (ECP), ktorá je potrebná pre správne fungovanie nervového prenosu a života schopnosť buniek. Majú zásadnú úlohu pri vývoji mozgu (Christopherson a kol., 2005), a fyziologických i patologických procesoch, ktoré v ňom prebiehajú (Parpura a kol., 2012, Pekný a kol., 2019). Počas starnutia prebiehajú zmeny v celom centrálnom nervovom systéme (CNS), a výnimkou nie sú ani astrocyty (Rodríguez a kol., 2014). Napriek tomu, že počas starnutia sa ich počet v mozgu neznižuje (Pelvig a kol., 2008, Fabricius a kol., 2014, Grosche a kol., 2013), štúdie ukázali, že sa môže meniť ich morfológia a znižovať ich funkčnosť (Rodríguez a kol., 2014).
Hypotéza:Predpokladáme, že v priebehu starnutia dochádza v tkanive CNS k zmenám (zápal, hypometabolizmus), na ktoré astrocyty reagujú zmenou fenotypu na morfologickej, biochemickej i molekulárnej úrovni. To spôsobuje, že nie sú úplne schopné plniť svoje funkcie, ktoré súvisia s udržiavaním homeostázy extracelulárneho priestoru, najmä so schopnosťou regulovať množstvo extracelulárnych iónov a neuroaktívnych molekúl. Toto vychýlenie rovnovážneho stavu môže pre ostatné bunky CNS predstavovať dlhodobý stres a prispievať tak k rozvoju rozličných ochorení.
Cieľ projektu: Identifikovať zmeny, ktoré v astrocytoch prebiehajú počas starnutia z hľadiska funkcie membránových transportných proteínov a ich génovej expresie.
Metódy: V experimentoch sme používali transgénne GFAP/EGFP myši (Nolte a kol., 2001), v ktorých sú astrocyty vizualizované vďaka fluorescenčnému proteínu EGFP, ktorý je pod kontrolou ľudského promotéru pre gliálny acidický fibrilárny proteín (GFAP). Pokusy prebiehali na myšiach vo veku 3, 9, 12 a 18 mesiacov. Na identifikovanie zmien, ktoré v astrocytoch prebiehajú počas starnutia z hľadiska funkcie membránových transportných proteínov a ich expresie, sme sa rozhodli použiť 3 metódy: 3D konfokálnu morfometriu (Chvátal a kol., 2007a, Chvátal a kol., 2007b), imunohistochemickú analýzu a RT-qPCR.
Vďaka 3D konfokálnej morfometrii sme pozorovali objemové zmeny astrocytov na hipokampálnych mozgových rezoch, ktoré boli vystavené 20-minútovej aplikácii hypoosmotického stresu alebo roztoku so zvýšenou koncentráciou draslíku (50 mMK+). Na základe dát, ktoré sme získali aplikovaním roztoku so zvýšenou koncentráciou draslíku, sme neskôr zaradili ešte ďalšie – farmakologické merania. Rozhodli sme sa zmerať na objemové zmeny astrocytov po aplikácii roztoku so zvýšenou koncentráciou draslíku s pridaním inhibítorov TFB-TBOA (inhibítor glutamátového a glutamáto-aspartátového transportéru), bumetanide (inhibítor Na+-K+-Cl-kotransportéru) a DCPIB (inhibítor VRAC kanálov).
Metódu 3D konfokálna morfometria sme doplnili imunohistochemickou analýzou. Zamerali sme sa v nej predovšetkým na kvantifikáciu iónových kanálov a transportérov, ktoré sa podieľajú na procesoch esenciálnych pre zmenu objemu astrocytov. Konkrétne sme analyzovali glutamátové transportéry GLT-1 a GLAST, Na+-K+-Cl-kotransportér (NKCC-1) a objemovo regulované aniónové kanály VRAC ((z angl. volume regulated anion channels).
Tretia metóda, ktorú sme použili bola RT-qPCR. Pomocou nej sme sa snažili zistiť, ako sa v astrocytoch počas starnutia mení génová expresia rôznych iónových kanálov a neurotransmitérov. Do analýzy bolo zaradených 96 génov, ktoré kódujú nie len kanály a transportéry podieľajúce sa na iónovej homeostáze, ale aj typické markery astrocytov.
Výsledky: Po aplikácii hypoosmotického stresu sme zaznamenali rovnaký trend v objemovej regulácii astrocytov, vo všetkých vekových skupinách (nárast objemu <20%). Počas aplikácie roztoku s vysokou koncentráciou draslíku (50mM K+) sme identifikovali zaujímavý jav: astrocyty z 3 a 12 mesačných zvierat zväčšili svoj objem o 55-65%, zatiaľ čo astrocyty z 9 a 18 mesačných zvierat zväčšili svoj objem iba o 30-35%. Po preskúmaní ďalších štúdií (Cotrina a kol., 2001, Lewis a kol. 2012), sme vytvorili hypotézu, podľa ktorej tento rozdiel v objemových zmenách astrocytov v priebehu starnutia, môže byť spôsobený zníženou schopnosťou vychytávať glutamát, pufrovať ióny K+alebo zníženou schopnosťou regulovať objem prostredníctvom VRAC kanálov. Aby sme našu hypotézu potvrdili, aplikovali sme na mozgové rezy 3 inhibítory: TFB-TBOA (inhibítor glutamátového a glutamáto-aspartátového transportéru), bumetanide (inhibítor Na+-K+-Cl-kotransportéru) a DCPIB (inhibítor VRAC kanálov). Výsledky, ktoré sme získali s použitím 3D konfokálnej morfometrie a imunohistochemickej analýzy naznačujú, že odlišný rozsah objemových zmien astrocytov v hipokampe počas starnutia je spôsobený klesajúcou účasťou Na+-K+-Cl-kotransportéru, glutamátových transportérov, glutamátovo-aspartátového transportétu 1 a VRAC kanálov. Zaujímavé je, že podľa našich výsledkov dochádza v hipokampálnych astrocytoch počas starnutia k redistribúcii iónov a kanálov zodpovedných za udržiavanie iónovej homeostázy, z tela astrocytov do ich výbežkov.
Chcela by som poďakovať predovšetkým mojej školiteľke Ing. Miroslave Anděrovej CSc., pod ktorej vedením pracujem nie len na svojej dizertačnej práci, ale úspešne som obhájila aj bakalársku a magisterskú záverečnú prácu. Okrem toho by som rada poďakovala všetkým spoluautorom, ktorí sa na tomto projekte podielali.
Podrobné výsledky boli publikované v januárovom vydaní odborného časopisu Neurobiology of Aging pod názvom High potassium exposure reveals altered ability of astrocytes to regulate their volume in aged hippocampus of GFAP/EGFP mice. Projekt podporili: Grantová Agentúra Karlovej Univerzity (GAUK 636316), Grantová Agentúra Českej Republiky (GAČR p304/12/G069, GAČR 13-02154S).
Christopherson, K. S., Ullian, E. M., Stokes, C. C. a, Mullowney, C. E., Hell, J. W., Agah, A., and Barres B. 2005. Thrombospondins Are Astrocyte-Secreted Proteins that Promote CNS Synaptogenesis. Cell 120:421–433.
Chvatal A., Anderova M., Hock M., Prajerova I., Neprasova H., Chvatal V., Kirchhoff F. and SE. 2007. Three-Dimensional Confocal Morphometry Reveals Structural Changes in Astrocyte Morphology In Situ. J Neurosci Res 85:260–271.a
Chvátal A, Anděrová M, Kirchhoff F. 2007. Three-dimensional confocal morphometry -a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices. J Anat 210:671–683.b
Cotrina ML, Gao Q, Lin JHC, Nedergaard M. 2001. Expression and function of astrocytic gap junctions in aging. Brain Res 901:55–61.
Fabricius K, Jacobsen JS, Pakkenberg B. 2013. Effect of age on neocortical brain cells in 90+ year old human females-a cell counting study. Neurobiol Aging [Internet] 34:91–99. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.neurobiolaging.2012.06.009
Grosche A, Grosche J, Tackenberg M, Scheller D, Gerstner G, Gumprecht A, Pannicke T, Hirrlinger PG, Wilhelmsson U, Hüttmann K, Härtig W, Steinhäuser C, Pekny M, Reichenbach A. 2013. Versatile and Simple Approach to Determine Astrocyte Territories in Mouse Neocortex and Hippocampus. PLoS One 8.
Lewis D.K., Kristen T. T., Selvamani A. and SF. 2012. Age-related severity of focal ischemia in female rats is associated with impaired astrocyte function. Neurobiol Aging 33:1123e1-1123.16.
Nolte C., Matyash M., Pivneva T., Schipke C.G., Ohlemeyer C., Hanisch U. and DM. 2001. GFAP Promoter-Controlled EGFP-Expressing Transgenic Mice: A Tool to Visualize Astrocytes and Astrogliosis in Living Brain Tissue. Glia 33:72–86.
Parpura V, Heneka MT, Montana V, Oliet SHR, Schousboe A, Haydon PG, Stout RF, Spray DC, Reichenbach A, Pannicke T, Pekny M, Pekna M, Zorec R, Verkhratsky A. 2012. Glial cells in (patho)physiology. J Neurochem 121:4–27.
Pekny M, Wilhelmsson U, Tatlisumak T, Pekna M. 2018. Astrocyte activation and reactive gliosis—A new target in stroke? Neurosci Lett [Internet] 689:45–55. Available from: https://doi.org/10.1016/j.neulet.2018.07.021
Pelvig DP, Pakkenberg H, Stark AK, Pakkenberg B. 2008. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiol Aging 29:1754–1762.
Rodríguez JJ, Yeh CY, Terzieva S, Olabarria M, Kulijewicz-Nawrot M, Verkhratsky A. 2014. Complex and region-specific changes in astroglial markers in the aging brain. Neurobiol Aging [Internet] 35:15–23. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.neurobiolaging.2013.07.002