INTERAKTÍVNA KONFERENCIA
MLADÝCH VEDCOV

Model ventrálneho kaudálneho nervu potkana: kvantifikačná štúdia motoneurónov v mieche

Zuzana Dzurjašková 1 Juraj Blaško 1 Ivo Vanický 1

1Neurobiologický ústav Biomedicínskeho centra SAV, Košice, Slovensko
dzurjaskova@saske.sk

Poranenia periférnych nervov patria medzi pomerne častý typ zranení v rámci nervového systému, ich incidencia v Európe predstavuje asi 300 000 prípadov a okrem poškodenia motorických a senzitívnych funkcií sú aj hlavným zdrojom bolestivých neuropatií. V experimentoch základného výskumu zacielených na nájdenie efektívnej terapie, sa pre hodnotenie miery regenerácie využívajú viaceré prístupy ako napríklad kvantifikácia regenerujúcich axónov, elektrofyziológia alebo meranie hrúbky myelínovej pošvy. Overenou metódou používanou na hodnotenie obnovenia axónálneho transportu a teda miery úspešného prepojenia miesta poškodenia nervu s centrom je retrográdna technika značenia motorických neurónov v CNS. Hlavným cieľom tejto práce bolo preto zmapovať a kvantifikovať populáciu motoneurónov nachádzajúcich sa v predných rohoch miechy a  tvoriacich ventrálny kaudálny nerv potkana. Tento nerv využívame v našom laboratóriu ako model pri regeneračných štúdiach poranenia periférneho nervu vďaka jeho dobrej prístupnosti a dĺžke. Na účel retrográdneho značenia motoneurónov sme využili fluorescenčný značkovač Fluorogold, ktorý sme aplikovali do trubičky nasadenej na proximálny kýpeť transekovaného chvostového nervu potkana kmenňa Wistar (n=10; b.w=300 – 320g). Po 7 – dňovom prežívaní boli zvieratá transkardiálne prepláchnuté fyziologickým roztokom a 4% paraformaldehydom v 0,1 M PB. Našim vedľajším cieľom bolo porovnať dve metódy spracovania tkaniva a ich vplyv na kvantifikáciu. Miechy v prvej skupine zvierat (n=5) sme spracovali metódou sériových rezov (20 μm) na vibratóme a miechy v druhej skupine (n=5) boli spracované metódou prejasnenia (clearing) - RetroDISCO (Žygelyte 2016). Fluorogold pozitívne bunky sme potom rátali manuálne s pomocou fluorescenčného mikroskopu. Kvantifikácia ukázala, že v prípade klasického spracovania tkaniva boli počty neurónov v priemere 244 (S.D±39.51), zatiaľčo počet neurónov v prejasnenom tkanive bol 178.4 (S.D± 16.05). Keďže v prípade hodnotenia sériových rezov existuje riziko viacnásobného započítania tej istej bunky a tým celkového nadhodnotenia výsledného počtu, považujeme druhú metodiku za presnejšiu. Jej ďalšou výhodou je aj menšia časová náročnosť. Tieto výsledky budú východiskom pre naše ďalšie experimenty v oblasti neuroregenerácie.

Práca vznikla za podpory grantov VEGA 2/0123/20; VEGA 2/0109/21, doktograntom APP0174 a ITMS 2014+: 313011V455, ITMS 2014+: 313011V344, ITMS 2014+: 313011D103.
Žygelyte, E., et al. (2016). RetroDISCO: Clearing technique to improve quantification of retrograde labeled motor neurons of intact mouse spinal cords. J Neurosci Methods 271: 34 – 42.