Heterologická expresia a purifikácia neuropeptidu ITPL z Bombyx mori v Escherichia coli

Heterologická expresia a purifikácia neuropeptidu ITPL z Bombyx mori v Escherichia coli

Celkové hodnotenie

Vedecká práca
100%
Prevedenie (dizajn)
100%
Diskusná interakcia
100%
PoužívateľVedecká prácaDizajnDiskusná interakcia
Bc. Veronika Krchlíková100%100%100%
Mgr. Eva Struhárňanská100%100%-
ISBN: 978-80-972360-1-4

Heterologická expresia a purifikácia neuropeptidu ITPL z Bombyx mori v Escherichia coli

Andrea Hubináková1 , Zdenko Levarski2 , Stanislava Bírová , Eva Struhárňanská , Stanislav Stuchlík , Ján Turňa
1 Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra molekulárnej biológie, Mlynská dolina, Ilkovičova 6, 842 15 Bratislava, Slovenská republika
2 Univerzita Komenského v Bratislave, Vedecký park, Ilkovičova 8, 842 16 Bratislava, Slovenská republika
a.hubinakova@gmail.com

Iónový transportný peptid (ITP) a jeho alternatívna zostrihová varianta, proteín podobný iónovému transportnému peptidu (ITPL) sú hmyzie neuropeptidy. Tieto peptidy boli identifikované ako modulátory homeostatických mechanizmov u hmyzu v prednej časti zadného čreva (ileum). Biologicky aktívny ITPL obsahuje 6 cysteínov, ktoré vytvárajú tri vysoko konzervované intramolekulové disulfidové väzby, podobne ako u ITP [1-2]. Štúdie zamerané na funkciu ITPL u hmyzu nie sú až také rozsiahle a práve z tohto dôvodu sme sa zamerali na produkciu tohto proteínu v Escherichia coli.

Počet disulfidových väzieb a veľkosť ITPL (9 kDa) proteínu vytvára limitácie pri produkcii správne poskladaného proteínu v cytoplazme Ecoli. Aj napriek všetkým výhodám produkcie proteínov v Ecoli, cytoplazma divokého kmeňa neposkytuje vhodné  prostredie na tvorbu disulfidových väzieb. To môže viesť k vytváraniu nerozpustných agregátov- inklúznych telesiok. Na zníženie alebo zamedzenie tvorby inklúznych teliesok  sa používajú viaceré stratégie napr. použitie jedného alebo kombináciu viacerých fúznych partnerov, optimalizácia kultivačných podmienok, zloženie média a teplota pri heterologickej expresii, a iné [3-4].

Cieľom tohto projektu je nadprodukcia fúzneho proteínu ITPL (23 kDa) v solubilnej forme a jeho purifikácia na následné využitie pri funkčných štúdiách v hmyzom modelovom organizme, Bombyx mori.

Poďakovanie: 

Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci operačného programu Výskum a inovácie pre projekt: Univerzitný vedecký park Univerzity Komenského v Bratislave – 2. Fáza, ITMS 2014+ 313021D075, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.“ a tiež projektu „Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov“ (BIOREKPROT - ITMS: 26240220048).

Zdroje: 

[1] Meredith J., Ring M., Macins A., et al. (1996) J. Exp. Biol. 199(Pt5), p. 1053.
[2] Nagai C., Mabashi-Asazuma H., Nagasawa H., et al. (2014) J. Biol. Chem 289(46), p. 32166.
[3] Levarski Z., Šoltýsová A., Krahulec J., et al. (2014) Protein Expres. Purif. 100, p. 40.
[4] Ke N., Berkmen M. (2014) Curr. Protoc. Mol. Biol. 108(16), p. 1.

Diskusia