Dvojrozmerná gélová elektroforéza je spojením izoelektrickej fokusácie a SDS elektroforézy, čo umožňuje analýzu proteínov v rádoch stoviek až tisícok zároveň na jednom géle, a to i predchádzajúcich znalostí o vlastnostiach týchto proteínov [1]. Samotná príprava vzorky pred 2D elektroforézou je jedným z najdôležitejších krokov vôbec, zároveň je ale aj jedným z najproblematickejších. Pri maku siatom (Papaver somniferum) je extrakcia proteínov o to zložitejšia, že obsahuje vysoké percento lipidov, preto nie je možná identifikácia proteínov pomocou klasických metód ako je samostatná SDS – PAGE.
V tejto práci sme sa analyzovali 48 vzoriek maku siateho, slovenské genotypy Albín, Belgarn, Gerlach, Manor, Malsar, Opál a Maratón. Semená maku sme mechanicky zhomogenizovali v trecej miske a následne realizovali extrakciu proteínov viacerými protokolmi: podľa Hurkmana a Tanaku (1986, upravený) [2], podľa Evangelista et al. (1998) a extrakciou len pomocou izopropanolu. Na prípravu vzoriek pre IEF sme použili komerčne dostupný ReadyPrep™ 2 – D Starter Kit od firmy Bio – Rad. Obsah proteínov vo vzorkách sme stanovili spektrofotometricky podľa Bradforda (1976) [4] pri 590 nm. Detegovali sme variabilnú výťažnosť proteínu v závislosti od použitého protokolu.
Najnižšiu výťažnosť proteínu (0,06 mg.ml-1 ± 0,04 mg.ml-1) sme získali izopropanolovou extrakciou. Najvyššiu výťažnosť proteínu (2,51 mg.ml-1 ± 0,35 mg.ml-1) sme získali protokolom podľa Hurkmana a Tanaku s upravenou koncentráciou fenolového extrakčného činidla (0,4 mol.dm-3). Vzorky získané touto extrakciou sme následne podrobili 2D gélovej elektroforéze a gély vizualizovali Coomasie Brilliant Blue R250. Extrakčným protokolom podľa Evangelista et al. sme síce nezískali najvyššiu výťažnosť (1,32 mg.ml-1 ± 0,35 mg.ml-1), avšak je možné pomocou fosforečnanu sodného samostatne separovať albunínovú a globulínovú frakciu, ktoré bude možné podrobiť ďalším analýzam.
Tato štúdia vznikla vďaka podpore v rámci OP Výskum a vývoj pre projekt: Vývoj nových typov rastlín s geneticky upravenými znakmi hospodárskeho významu ITMS : 26220220189, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja
[1] Kellner R.L.F., Meyer H.E., Wiley V.CH., John Wiley & Sons, 2nd, 1999, 325.
[2] Hurkman, W. J. and Tanaka, C. K., Plant Physiol., 81, 1986, 802–806.
[3] Evangelista R.L., Kusnadi A.R., Howard J.A., Nikolov Z.L., Biotechnol Prog, 14, 1998, 607–614.
[4] Bradford, M.M. Analytical Biochemistry, 1976. 72, 248-254.
Otazka
Dobry den, chcel by som sa opytat, v com spociva priprava vzoriek pomocou toho kitu od Bio-Radu? Dakujem.
Re: Otazka
Dobrý deň,
treba si uvedomiť, že po extrakcii sme získali len "hrubú vzorku", teda pelet, ktorý bolo treba rozsuspendovať vo vhodnom roztoku, tj. IEF pufor obsiahnutý v kite, následne sa až takto pripravené vzorky inkubujú s IPG stripmi a púšťa prvý rozmer.. po tejto fáze treba pred SDS-PAGE stripy ekvilibrovať dvoma rozdielnymi roztokmi, i tieto boli obsiahnuté v kite. Samozrejme je možné si tieto roztoky pripraviť aj samostatne.
Re: Re: Otazka
Dakujem za odpoved, a co priblizne obsahuje ten pufor? Nejaku ureu alebo sa tam nachadza nieco specialne pre ten kit? Dakujem.
Re: Re: Re: Otazka
Presne tak, v podstate dodali 10ml pufru v zložení (presne opísané z kitu): 8M urea, 2% CHAPS, 50mM DTT, 0,2% 3/10 amfolyt a farbička Bromfenolova modrá.. nič, čo by sa nedalo namiešať priamo v labáku, ale ako starter kit potešilo (firma to dodala k prístroju aj s balíčkom 3/10stripov)
Re: Otazka
Dobrý deň,
treba si uvedomiť, že po extrakcii sme získali len "hrubú vzorku", teda pelet, ktorý bolo treba rozsuspendovať vo vhodnom roztoku, tj. IEF pufor obsiahnutý v kite, následne sa až takto pripravené vzorky inkubujú s IPG stripmi a púšťa prvý rozmer.. po tejto fáze treba pred SDS-PAGE stripy ekvilibrovať dvoma rozdielnymi roztokmi, i tieto boli obsiahnuté v kite. Samozrejme je možné si tieto roztoky pripraviť aj samostatne.