CRISPR-Cas9 sprostredkovaná editácia karbonickej anhydrázy IX v nádorových bunkách

Karbonická anhydráza IX (CA IX) predstavuje rakovinovo-asociovaný proteín, ktorého expresia koreluje s hypoxickými oblasťami solídnych tumorov [1]. Tento transmembránový proteín katalyzuje reverzibilnú reakciu oxidu uhličitého s vodou za vzniku bikarbonátu a protónu, vďaka čomu sa podieľa na regulácii vnútrobunkového pH za podmienok nádorovej acidózy [2]. Inhibícia katalytickej aktivity CA IX alebo jej samotnej expresie vedie k potlačeniu rastu nádorových buniek in vitro [3] a aj nádorov ako takých in vivo [4]. CRISPR-Cas9 systém genomickej editácie predstavuje jednoduchý systém zavádzania cielených mutácii do genómov nádorových bunkových línií. Je odvodený od bakteriálneho adaptívneho imunitného systému, ktorý je založený na cielenom štiepení DNA sekvencií exogénneho pôvodu [5]. Targeting sekvencií je umožnený vďaka asociácii s komplementárnymi sekvenciami gRNA, ktoré vytváraju komplex s nukleázou. Modifikáciou tohto systému vznikol flexibilný spôsob ako je expresiou navrhnutých gRNA možné zavádzať dvojvláknové zlomy na definované úseky v genóme. Následná oprava vedie k vzniku náhodných mutácii, výsledkom ktorých je knock-out (KO) zasiahnutého génu [6]. Našim cieľom bolo pripraviť sériu jednoduchých KO mutantov v géne pre karbonickú anhydrázu IX (CA9) pomocou CRISPR-Cas9 editačného systému v nádorovej bunkovej línii HT1080. Sledovanie vplyvu mutácii CA IX proteínu vytvorených v prirodzenom genomickom prostredí nádorovej línie (CA9 gén) môže predstavovať nový model štúdia jej funkcie in vitro aj in vivo.