Deaminácia cytozínových báz na deoxyuracil komplikuje sekvenovanie FFPE materiálu pomocou aj Sangerovej metódy aj pri sekvenovaní druhej generácie

FFPE (formalin-fixed, paraffin-embedded) DNA má svoje obmedzenia pre testovanie mutácii, pretože fixácia formalínom a zaliatie do parafínu, podmienky skladovania a doba skladovania spôsobia fragmentáciu DNA a chemické modifikácie molekúl. Avšak deaminácia cytozínových báz na deoxyuracil komplikuje sekvenovanie DNA pomocou aj Sangerovej metódy, aj pri sekvenovaní druhej generácie. Izolácia DNA z FFPE tkaniva a jej následné použitie je spojené s niekoľkými zmenami. Jedným z hlavných problémov súvisiacich s FFPE DNA je výskyt sekvenačných artefaktov, čo predstavuje zjavné sekvenačné zmeny, ktoré nie sú prítomné v pôvodnom templáte. Tieto zmeny vedú k C–T prestavbe v sekvenačných reakciách. Medzi sekvenačnými artefaktmi zistenými v FFPE DNA sú premeny C:G>T:A variantov najčastejším typom SNV (Single Nucleotide Variant). Také artefakčné C:G>T:A varianty môžu byť výrazne znížené po opracovaní FFPE DNA s enzýmom UDG (Uracil-DNA Glycosylase) pred PCR amplifikáciou, čo naznačuje, že uracilové lézie sú hlavným zdrojom artefakčných C:G>T:A variantov v FFPE DNA. UDG môže špecificky odstrániť deaminované cytozínové bázy z DNA získanej z FFPE vzorky. Ukázalo sa, že úspešnosť amplifikácie DNA z FFPE tkanív, v porovnaní s „čerstvou“ DNA, sa výrazne zníži. Na analýzu bola použitá krv obidvoch rodičov a na získanie DNA z plodu bol k dispozícii FFPE materiál z potrateného plodu, pričom vek tkaniva v čase izolácie DNA bol 23 mesiacov. Pomocou sekvenovania druhej generácie sa ukázalo, že obaja rodičia boli heterozygoti pre deléciu v CC2D2A géne, avšak táto metóda nebola účinná pre FFPE vzorku. Po opracovaní UDG, DNA extrahovaná z FFPE vzorky je účinná na testovanie mutácii použitím Sangerovho sekvenovania. Zistilo sa, že plod bol homozygotom pre deléciu v CC2D2A géne. Pomocou sekvenovania druhej generácie a Sangerovho sekvenovania sa podarilo odhaliť príčinu daného potratu. Ukázalo sa, že obaja rodičia boli heterozygoti pre deléciu v géne CC2D2A a plod bol homozygot pre deléciu v tom istom CC2D2A géne, ktorý je asociovaný s Meckel-Gruber syndrómom.