FARMAKOLOGICKÝ VPLYV KYSELINY ACETYLSALICYLOVEJ NA EXPRESIU PROTEÍNOV BAX A BCL-2 V ĽUDSKÝCH GINGIVÁLNYCH FIBROBLASTOCH IN VITRO

Úvod: Nesteroidné protizápalové liečivá (NSAID) sú skupinou liečiv, ktorá je rôznorodá z hľadiska chemickej štruktúry aj mechanizmu účinku (Lomakin and Gruzdev, 2011). Kyselina acetylsalicylová (ASA) sa štandardne používa ako nesteroidné antiflogistické liečivo, ktoré má potenciál zasahovať do mnohých biologických dráh (de Souza Rendohl et al., 2021). Má schopnosť ireverzibilne inhibovať enzým cyklooxygenázu 1 (COX), ktorá sa zúčastňuje kaskády v syntéze tromboxánov (TX) a ochranných prostaglandínov (PG) a reverzibilne inhibuje COX 2, ktorej funkcia spočíva v syntéze prozápalových PG. ASA inhibuje premenu kyseliny arachidónovej na PG a bráni tvorbe eikozanoidov (Biondo-Simões et al., 2021), čím blokuje aj prejavy zápalu a bolesti (Zafarmand et al., 2022). ASA okrem antiagregačného a antiflogistického účinku moduluje diferenciáciu buniek zubnej drene (Divya et al., 2021). Liečba s ASA je schopná signifikantne zlepšiť osteogénnu diferenciáciu (Liu et al., 2015). To podporuje hypotézu, že ASA by mohla podporiť funkcie kmeňových buniek a byť značne používaná v bunkovej terapii (Abd Rahman, 2021). Dôležitá je dávka, v ktorej sa ASA aplikuje a aké koncentrácie v organizme vytvorí. Pri vyšších koncentráciách má schopnosť indukovať apoptózu, čo v regeneratívnej terapii nie je zámerom, ale táto vlastnosť môže byť využitá v liečbe malignít. Apoptóza je charakteristická zmenami v proteosyntéze. Rovnováha medzi antiapoptotickým proteínom BCL-2 a proapoptotickým BAX sa môže farmakologickou intervenciou narušiť, čím vznikajú antiapoptické alebo proapoptické zmeny v bunkách (Bloch et al., 2021; Zimmermann et al., 2000). Metodika: Bunkovým modelom použitým v tomto experimente bola kultúra ľudských gingiválnych fibroblastov (HGF). HGF sme kultivovali pri štandardných kultivačných podmienkach (5% CO2, 37°C) v kompletnom kultivačnom médiu pozostávajúcom z Dulbecco´s modified Eagle´s medium - Low glucose + 10% Fetal bovine serum + 1% 100U/ml streptomycín/ 100µg/ml penicilín (Sigma-Aldrich). Po dosiahnutí 85% konfluencie sme HGF pasážovali. HGF v 5.pasáži boli následne ovplyvnené dvomi rozličnými koncentráciami ASA po časový interval 24 hod. Vzorky HGF sme rozdelili do troch skupín, prvá skupina predstavovala kontrolné vzorky bez ovplyvnenia ASA, druhá skupina predstavovala vzorky ovplyvnené 30 µM koncentráciou ASA korelujúcou s bežnou terapeutickou dávkou 500 mg, a tretia skupina predstavovala vzorky ovplyvnené 100 µM koncentráciou ASA, čo predstavuje terapeutickú dávku viac ako 1500 mg. Prietokovou cytometriou (MACSQuant Analyze, Miltenyi Biotec) sme analyzovali viabilitu HGF a prítomnosť povrchových markerov (CD73, CD90, CD105), ktoré sú špecifické pre bunky mezenchýmového pôvodu. Získané dáta analýzy sme vyhodnotili v programe MACSQuant (Miltenyi Biotec). Metódou Western blotting sme detekovali relatívnu expresiu proteínov BAX a BCL-2 normalizovanú na relatívnu expresiu referenčného proteínu GAPDH. Na detekciu expresie proteínov sme použili chemiluminiscenčnú reakciu s luminolom. Kvantitatívne vyhodnotenie nálezov na membráne sme vykonali denzitometrickou analýzou v programe ImageQuant TL Toolbox version 8.1 (GE Healthcare, UK). Záver: Viabilita HGF analyzovaná metódou prietokovej cytometrie sa medzi skupinami vzoriek HGF významne nemenila. Vo všetkých prípadoch percento viabilných buniek presahovalo 94,5% (obr. 1). Prietokovou cytometriou sme hodnotili aj pozitivitu HGF na povrchové markery charakteristické pre bunky mezenchymálneho pôvodu (CD73, CD90, CD105). Kontrolná skupina HGF a tiež aj skupiny ovplyvnené ASA vykazovali pozitivitu na prítomnosť uvedených markerov. Z pohľadu bunkovej apoptózy a jej možného ovplyvnenia ASA sme sa zaoberali sledovaním relatívnej expresie proapoptického BAX a antiapoptického BCL-2 proteínu pomocou metódy Western blotting. Expresia BAX a BCL-2 a ich pomer (BAX/BCL-2) má prognostický aj prediktívny význam bunkovej apoptózy (Khodapasand et al., 2015). Výsledky experimentu preukázali značný nárast číselného pomeru BAX/BCL-2 (obr. 2). Uvedený pomer udáva, či došlo k antiapoptickým prípadne proapoptickým zmenám. Nízky pomer BAX/BCL-2 je typický pre bunky odolné voči apoptóze, vysoký pomer BAX/BCL-2 je typický pre bunky senzitívne, náchylnejšie na apoptózu (Raisova et al., 2001).