Peroxidázy sa všeobecne klasifikujú do skupiny oxidoreduktáz. Sú druhou najväčšou enzýmovou triedou používanou v biotechnologických aplikáciach. Tieto enzýmy sa používajú na katalýzu rôznych oxidačných reakcií s použitím peroxidu vodíka a iných substrátov, ako donorov elektrónov. Peroxidázové enzýmy sú využiteľné v mnohých oblastiach od bioenergetiky až po bioremediácie. Funkcia peroxidáz závisí aj od ich pôvodu alebo zdroja [1]. Ektomykorízne huby sú potenciálnym rezervoárom peroxidázových génov. Napríklad genóm Cortinarius glaucopus kóduje 11 peroxidáz, pričom tento počet je porovnateľný s mnohými drevokaznými hubami [2]. Niektoré druhy húb sa prednostne vyskytujú v lesoch s vysokým stupňom prirodzenosti [3]. Badínsky prales zahŕňa pralesovité klimaxové lesné spoločenstvá bukového vegetačného stupňa, kde sú zastúpené všetky tri základné vývojové štádia pralesov na územi Európy. V národnej prírodnej rezervácii Badínsky prales je podmienený výskyt špecifickej mykoflóry, typickej pre špecifické ekologické a klimatické podmienky karpátskych pralesov [4]. Hlavným cieľom tejto práce bolo amplifikovať gény kódujúce peroxidázy z ektomykoríznych húb a stanoviť primárnu štruktúru týchto génov. V tejto práci sme sa najskôr venovali izolácii metagenómu z pôdnych vzoriek, ktoré pochádzali z rôznych časti Badínského pralesa. Rovnako sme izolovali genómy z hubových plodníc, ktoré pochádzali z pohoria Vtáčnik a z mesta Bratislava. Následne sme prevádzali PCR amplifikáciu peroxidázových génov, respektíve ich častí, kedy boli ako templáty použité izolované genómy a metagenómy. V týchto reakciách boli použité primery série SlutHTP4c navrhnuté voči začiatku a koncu známeho peroxidázového génu SlutHTP4 pre fungálny druh Suillus luteus. Rovnako sme prevádzali PCR amplifikáciu so SlutHTP4a primermi, navrhnutými voči úsekom v konzervovanej oblasti katalytického jadra tejto peroxidázy, ktorých výsledkom boli kratšie úseky génov. Získali sme PCR produkty, pomocou ktorých sme po vytvorení genómových knižníc a ich následnom Sangerovom sekvenovaní, vedeli k danej sekvencii priradiť peroxidázu z konkrétneho fungálneho druhu s najvyššou identitou. Na tento účel sme použili online databázy blastX (NCBI) a Uniprot. Použitím primerov SlutHTP4a sa nám doteraz podarilo zachytiť a identifikovať 8 konzervovaných úsekov peroxidázových génov zo vzoriek z Badínského pralesa a 1 takýto úsek zo vzorky z mesta Bratislava. Kompletný peroxidázový gén sme zachytili pomocou primerov SlutHTP4c z hubovej plodnice pochádzajúcej z pohoria Vtáčnik. Ide o gén s veľkosťou 812 nukleotidov, ktorý v databázach vykazoval najvyššiu podobnosť s chlóroperoxidázou z ektomykoríznej huby Suillus occidentalis (KAG1761790.1), pričom sa s touto sekvenciou zhoduje na 89 %.
Our research was supported by the Slovak Grant Agency with project VEGA 2/0012/22 and by the Slovak Research and Development Agency with project APVV-20-0284.
[1] Twala, P. P., Mitema, A., Baburam, C., & Feto, N. A. (2020). Breakthroughs in the discovery and use of different peroxidase isoforms of microbial origin. AIMS microbiology, 6(3), 330.
[2] Bödeker, I. T., Clemmensen, K. E., de Boer, W., Martin, F., Olson, Å., Lindahl, B. D. (2014). Ectomycorrhizal C ortinarius species participate in enzymatic oxidation of humus in northern forest ecosystems. New Phytologist, 203(1), 245-256.
[3] Kunca, V., Peiger, M., Tomka, P., Vampola, P. (2022). Old-growth forest fungi--new localities and habitat and host preferences in Slovakia (I). Czech Mycology, 74(1).
[4] Mihál, I. (2013). K poznaniu mykoflóry (Ascomycota, Basidiomycota, Deuteromycota–Fungi imperfecti) Národnej prírodnej rezervácie Badínsky prales. Natura Carpatica, 54, 7-16.