Kvantitatívna analýza monoklonálnych protilátok vo farmaceutických matriciach metódou kapilárnej elektroforézy v spojení s hmotnostnou spektrometriou

Terapeutické monoklonálne protilátky (mAbs) sú imunoglobulíny typu IgG1 alebo IgG4, ktoré sa využívajú ako biofarmaká vykazujúce vysoko selektívnu väzbu na špecifické antigény alebo epitópy. MAbs sa využívajú na terapiu mnohých ochorení ako napríklad nádorových ochorení, autoimunitných ochorení, či vírusových infekcií [Alejandra et al., 2023]. V posledných rokoch došlo k expanzii produkcie terapeutických mAbs. Aktuálne Food and Drug Administration (FDA) registruje 125 mAbs schválených na liečbu, zatiaľ čo Európska lieková agentúra (EMA) 112 mAbs [The Antibody Society, 2024]. Najčastejšou metódou využívanou pre stanovenie mAbs je enzýmová imunosorbentná analýza (angl. ELISA). Niektoré nevýhody ELISA testu viedli k rozvoju chromatografických techník spoločne s hmotnostnou spektrometriou (MS) pre kvantitatívne analýzy mAbs. Kvapalinová chromatografia (LC) MS využíva najčastejšie tzv. „bottom-up“ metódu, kde je mAb enzymaticky natrávená na menšie peptidy. Táto práca je zameraná na využitie metódy s jednoduchšou prípravou vzorky, tzv. „middle-up“ metódy stanovenia mAbs, kde je mAb redukovaná na menšie proteínové podjednotky, v spojení s kapilárnou elektroforézou (CE). CE má mnohé výhody ako vysoká separačná účinnosť, absencia stacionárnej fázy a nízka spotreba chemikálií a vzorky, ktoré sú v kombinácii s MS ideálne na analýzu proteínov [Tomasovsky et al., 2023]. Zásobný roztok 1 mg/mL referenčného štandardu infliximabu (IFX) (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, US) bol redukovaný činidlom tris(2-carboxyetyl)fosfín (TCEP). IFX bol po pridaní TCEP inkubovaný pri 37 °C po dobu 1 hodiny. Pre CE analýzu redukovanej mAb bola použitá nepokrytá kremenná kapilára (83 cm, i.d. 50 μm). Pre optimalizáciu vodiaceho elektrolytu (BGE) boli testované rôzne koncentrácie kyseliny mravčej a octovej. Separačné napätia boli testované v rozmedzí 18–25 kV. MS analýza bola vykonaná v skenovacom režime a SIM režime. Získané predbežné výsledky ukazujú, že optimálny BGE je 1 M kyselina mravčia pri optimalizovanom separačnom napätí 25 kV. Pri týchto podmienkach bola dosiahnutá aj separácia ľahkých a ťažkých IFX reťazcov. Následne sme validovali metódu CE-MS. S optimalizovanými parametrami boli získané aj ďalšie dáta, ktoré boli spracované pre stanovenie obsahu IFX vo farmaceutickej matrici (liečivo Remicade).