Hem-tiolátové peroxidázy (HTP), známe aj ako nešpecifické peroxygenázy (UPO) alebo chlóroperoxidázy (CPO) [1], tvoria novú rodinu fungálnych hem-tiolátových enzýmov, ktoré sú predmetom záujmu pre rôzne biotechnologické aplikácie [2]. Ukázali sa ako atraktívne biokatalyzátory pre selektívnu oxygenáciu, nakoľko na rozdiel od cytochrómov P450 závisia iba od peroxidu vodíka ako externého oxidantu [3]. Avšak napriek ich všestrannosti katalyzovať náročné selektívne oxyfunkcionalizácie je dostupnosť HTP enzýmov pre potenciálne biotechnologické aplikácie obmedzená. Preto stále prebiehajú identifikácie nových génov kódujúcich tieto biokatalyzátory. Vďaka tomu je potrebné ďalej charakterizovať skupinu týchto enzýmov, ako aj identifikovať nových vhodných kandidátov [4]. Hoci v sekvenovaných genómoch húb a iných zdrojoch bolo identifikovaných niekoľko tisíc génov kódujúcich hypotetické proteíny typu UPO, doteraz bolo experimentálne charakterizovaných iba niekoľko týchto enzýmov [2]. V tejto štúdii sa nám podarilo identifikovať nový gén hem-tiolátovej peroxidázy, ktorý nesie pomenovanie SuilspHTP4. Jeho prístupový kód v GenBank je OR148270. Celý gén pozostáva z 812 nukleotidov vrátane jedného intrónu s dĺžkou 56 nukleotidov. Aminokyselinová sekvencia tohto enzýmu pozostáva z 251 aminokyselinových zvyškov a najvyššiu homológiu vykazuje s génom SlutHTP4 zo Suillus luteus, pričom tu ide o 92 % identitu. Môžeme tak tvrdiť, že sa nám podarilo izolovať nový gén hem-tiolátovej peroxidázy. Na základe in silico analýzy sme zistili, že tento enzým má v rámci svojho aktívneho miesta zachovanú aminokyselinovú triádu proximálneho ligandu -P-C-P-, ktorý je kľúčový pre väzbu hemu. Rovnako je zachovaný motív -E-H-D-, ktorý je kľúčový pre väzbu kovového iónu. V zásade ide o Mg2+ alebo o Mn2+ [1]. Na základe týchto zistení predpokladáme, že enzým bude disponovať typickou katalytickou aktivitou pre hem-tiolátové peroxidázy. Následne sa budeme venovať heterológnej expresii génu SuilspHTP4, jeho purifikácii, charakterizácii a stanoveniu jeho enzýmovej aktivity.
Náš výskum bol podporený Vedeckou grantovou agentúrou projektom VEGA 2/0012/22 a Agentúrou na podporu výskumu a vývoja projektom APVV-20-0284.
[1] Zámocký, M., Hofbauer, S., Schaffner, I., Gasselhuber, B., Nicolussi, A., Soudi, M., Piker, K. F., Furtmüller, P. G., Obinger, C. (2015). Independent evolution of four heme peroxidase superfamilies. Archives of biochemistry and biophysics, 574, 108-119.
[2]Linde, D., Olmedo, A., González-Benjumea, A., Estévez, M., Renau-Mínguez, C., Carro, J., Fernández-Fueyo, E., Gutiérrez, A., Martínez, A. T. (2020). Two new unspecific peroxygenases from heterologous expression of fungal genes in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology, 86(7), e02899-19.
[3]Melling, B., Mielke, T., Whitwood, A. C., O’Riordan, T. J., Mulholland, N., Cartwright, J., Unsworth, W. P., Grogan, G. (2024). Complementary specificity of unspecific peroxygenases enables access to diverse products from terpene oxygenation. Chem Catalysis, 4(2).
[4] Kinner, A., Rosenthal, K., Lütz, S. (2021). Identification and expression of new unspecific peroxygenases–Recent advances, challenges and opportunities. Frontiers in bioengineering and biotechnology, 9, 705630.