Nádorové tkanivo sa vyznačuje kyslým extracelulárnym pH asociovaným so zvýšenou expresiou karbonickej anhydrázy IX (CAIX) indukovanou vplyvom hypoxie typickej pre toto mikroprostredie. Unikátnym štrukturálnym prvkom CAIX v rámci rodiny α karbonických anhydráz je proteoglykánu podobná (PG) doména, ktorá je pravdepodobne článkom zodpovedným za schopnosť CAIX nadobúdať optimálnu katalytickú aktivitu pri nízkom pH. Presné priestorové usporiadanie PG domény však doposiaľ popísané nebolo.
Preto bolo naším cieľom vyprodukovať rekombinantnú PG doménu v Escherichia coli a optimalizovať kultivačné kroky tak, aby ich bolo možné aplikovať pri produkcii 13C, 15N-značenej štruktúry určenej na NMR analýzu. Kvôli uľahčeniu exprimovateľnosti a purifikácie, bola PG doména produkovaná vo fúzii s tioredoxínom (Trx) a His-tagom. Z toho dôvodu sa naším cieľom stala tiež optimalizácia enzýmového štiepenia komplexu Trx-PG pomocou enterokinázy.
Vzhľadom na komplikácie pri detekcii a identifikácii jednotlivých štiepnych produktov bola vykonaná imunoprecipitácia s použitím anti-His protilátky za účelom oddelenia Trx (konjugovaného s His-tagom) a PG domény. Následne metódou SDS-PAGE a Western blotting bola detegovaná PG doména pomocou anti-CAIX protilátky (M75). Naviac, bola pozorovaná anomálna elektroforetická pohybllivosť PG domény pravdepodobne spôsobená jej vysoko kyslým charakterom, a teda nedostatočnou afinitou k SDS.
Táto práca vznikla vďaka podpore projektu „Univerzitný vedecký park Univerzity Komenského v Bratislave (ITMS 26240220086)“.