V procese iniciácie replikácie DNA dochádza k interakcii replikačných proteínov so špecifickou oblasťou DNA, ktorá je označovaná ako OriC. Hlavným iniciačným proteínom je DnaA proteín [1]. Práve interakcia OriC a DnaA proteínu je základnou podmienkou pre úspešnú iniciáciu replikácie DNA. K tejto interakcii dochádza na špecifických sekvenciách v rámci OriC, tzv. DnaA boxoch [2]. Vo všeobecnosti platí, že počiatok replikácie pozostáva z dvoch funkčných oblastí. Prvou je DnaA väzobná oblasť a druhou AT bohatý región. DnaA oblasť má viacero DnaA viažucich oblastí, ku ktorým patria aj DnaA boxy. DnaA boxy sú asymetrické 9 nukleotidov dlhé špecifické motívy, ktorých sekvencia, počet a rozloženie odráža diverzitu organizmov [3]. DnaA boxy tvoria miesto pre naviazanie DnaA monomérov, ktoré interagujú s OriC a vytvárajú štruktúru, ktorá je schopná rozrušiť dvojzávitnicu DNA. Komplex OriC-DnaA vytvorí torzné pnutie v DNA helixe, to sa sústreďuje na AT bohatý región a spúšťa rozpletanie dvojvlákna. V predchádzajúcej práci sme identofikovali predpokladaný počiatok replikácie v Acetobacter pasteurianus. Zamerali sme sa na cielenú PCR mutagenézu DnaA boxov a následné overenie schopnosti mutovaných počiatkov replikácie viazať DnaA iniciačný proteín. Predpokladaný počiatok replikácie sme klonovali do vektoru pGEM Teasy a PCR sme mutovali jednotlivé DnaA boxy alebo ich kombinácie. U takto pripravených mutantných formiem sme testovali väzbu s DnaA proteínm pomocou Electro Mobility Shift Assay.
[1] Wolański, M., Donczew, R., Zawilak-Pawlik, A., et al. (2015) Front. in Microbiology 5, p. 735.
[2] Saxena, R. (2013) OA Biochemistry 1(2), p. 13.
[3] Messer, W. (2002) FEMS Microbiology Reviews 26, p. 355.