Jedným z kľúčových faktorov pre heterologickú expresiu proteínov je počet kópií príslušného génu – ‘génová dávka’. Heterologický gén je zvyčajne umiestnený na plazmidovom vektore a použitie vysokokópiového plazmidu spravidla zvyšuje výťažok cieľového proteínu. Zároveň to však predstavuje pre bunku metabolickú záťaž, obzvlášť ak je produkovaný proteín pre hostiteľa toxický. Aj v prípade nízkej bazálnej expresie totiž dochádza k akumulácii toxického produktu do kritického množstva, čo vedie k spomaleniu rastu alebo bunkovej smrti. Selekcia v prospech bezplazmidových buniek môže spôsobiť stratu plazmidu na úrovni populácie. Pri nízkokópiových vektoroch je zas nevýhodou nižšie množstvo cieľového proteínu. Alternatívou je použitie plazmidu s regulovateľným počtom kópií. Nízky počet kópií počas väčšej časti bunkového cyklu redukuje metabolickú záťaž na bunku a zvyšuje stabilitu plazmidu. Po indukcii počet kópií narastá, čo by malo viesť k vysokému výťažku heterologického proteínu. Cieľom nášho výskumu je vytvoriť systém odvodený od R1 replikónu, v ktorom by bol počet kópií plazmidu regulovaný L-arabinózou indukovateľným PBAD promótorom. Prvým krokom bolo oddelenie cis a trans elementov replikónu pR1A plazmidu, čím sme potvrdili, že plazmid sa dokáže replikovať aj v prípade, že sú trans elementy (gény regulujúce replikáciu) umiestnené na inej molekule DNA.
Práca vychádza z projektu "Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov" (BIOREKPROT), na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja (ITMS:26240220048).
[1] Hughes J. E., Welker D. L. (1989) Plasmid. 22(3), p. 215.
[2] Aiba S., Tsunekawa H., Imanaka T. (1982) Appl. Environ. Microbiol. 43(2), p. 289.
[3] Preston A. (2003) Choosing a Cloning Vector. In: Casali N., Preston A. (ed.) E.coli plasmid vectors. Humana press, Inc., Totowa, New Jersey, USA, p. 19.
[4] Bittner M., Vapnek D. (1981) Gene. 15(4), p. 319.
[5] Del Solar G., Giraldo R., Ruiz-Echevarrı´a M. J., et al. (1998) Microbiol. Mol. Rev. 62, p. 434.
[6] Masai H., Arai K. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, p. 4781.
[7] Masai H., Kaziro Y., Arai K. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, p. 6814.
[8] Blomberg P., Nordstrom K., Wagner E. G. H. (1992) EMBO J. 11, p. 2675.
[9] Riise E., Stougaard P., Bindslev B., et al. (1982) J. Bacteriol. 151, p. 1136.
[10] Krahulec J., Hyršová M., Pepeliaev S., et al. (2010) Appl. Microbiol. Biotechnol. 8(1), p. 167.
[11] Birnboim, H. C., Doly, J. (1979) Nucleic Acids Res. 7(6), p. 1513.