Vplyv vysokých dávok ionizujúceho žiarenia (IR) na DNA je dlhodobo skúmaný a dostatočne známy. Človek sa však vo svojom životnom prostredí často stretáva s pôsobením nízkych dávok IR, ktorých zdrojom sú napr. roentgenové žiariče, počítačové tomografy, emisné tomografy, mamografy a z prírodných napr. kozmické žiarenie. Nízke dávky IR (1-10 cGy) môžu mať v organizme kumulatívny efekt v podobe poškodenej DNA. Jedny z najzavážnejších poškodení DNA - dvojreťazcové zlomy (DSB) sa u cicavcov najčastejšie opravujú nehomologickým spájaním koncov, za aktívnej interakcie s opravnými a signalizačnými proteínmi. V našej štúdii sledujeme tumor suppressor p53 binding protein 1 (53BP1), ktorý je kľúčovým regulátorom opravy dvojvláknových zlomov (Noon and Goodarzi 2011), vplýva na uprednostnenie nehomologického spájania koncov (NHEJ) a potlačenie homologickej rekombinácie (HDR). Zároveň sledujeme fosforylovaný proteín histone 2A family member X (γH2AX), ktorý sa uplatňuje pri organizácii eukaryotického chromatínu (Bonner, Redon et al. 2008) a je fosforylovaný na serínoch v oblasti dvojvláknových zlomov kinázami ATM, ATR a DNA-PK (Rogakou, Boon et al. 1999). Tieto proteíny dokážeme v bunkách efektívne vizualizovať pomocou flourescenčných markerov a následne kvantifikovať ako DNA opravné fokusy.
DSB patria k najdôležitejším molekulárnym poškodeniam vedúcim k tvorbe chromozómových translokácií/génových fúzií. Pokiaľ sa vyskytne translokácia v niektorom z protoonkogénov alebo antionkogénov, môže dôjsť k zmene ich funkcie, alebo aktivity a následne k transformácii bunky na nádorovú. Pri leukémii sa predpokladá, že dochádza k prvej udalosti – vzniku translokácie in utero v niektorom z génov kmeňových buniek. Následne sa z takejto kmeňovej bunky diferencuje rad krvotvorných buniek. Čím skôr sa tak stane, tým viac buniek nesie translokácie. Pokiaľ dôjde k druhej udalosti (translokácii) niekde inde v genóme, tá nie je schopná sa optimálne opraviť, čo vedie ku vzniku detskej akútnej lymfoblastickej leukémie (ALL) alebo akútnej myeloblastickej leukémie (AML) (Mori, Colman et al. 2002; Greaves and Wiemels 2003). Stanovenie DSB v bunkách pupočníkovej krvi po pôsobení nízkych dávok IR môže tak prispieť k štúdiu mechanizmov vzniku leukémie u detí.
Na kvantifikáciu DNA opravných fokusov, ich kolokalizáciu pomocou proteínov γH2AX a 53BP1 a fluorescenčne značených sekundárnych protilátok, boli použité čerstvé aj zamrazené bunky izolované z pupočníkovej krvi. Mikroskopické preparáty buniek po imunologickom farbení boli skenované automatizovaným Metafer systémom a následne vyhodnotené pomocou softvéru JCountPro. Výsledky boli porovnané s predchádzajúcou štúdiou, kde boli rovnaké bunky analyzované softwérom MetaCyte (Vokálová, 2014).
Analyzované bunky vykázali zvýšenú tvorbu DNA opravných fokusov v závislosti od dávky IR, pričom štatisticky významný efekt s použitím aritmetického priemeru sme zaznamenali pri dávke 5cGy pre proteíny 53BP1 (Ttest, p = 0,008) a γH2AX (Ttest, p = 0,041), zatiaľ čo pri kolokalizácii 53BP1/γH2AX sme zaznamenali štatisticky významný efekt už pri dávke 2 cGy (Ttest, p = 0,028). S použitím Poissonovho priemeru sme zaznamenali štatisticky významný efekt u 53BP1 (Ttest, p = 0,016) a γH2AX (Ttest, p = 0,048) už pri dávke 2cGy. Signifikantný rozdiel v tvorbe DNA opravných fokusov medzi hematopoetickými kmeňovými bunkami (s markerom CD34+) a ich diferencovaným potomstvom (CD34-) sa nám však nepodarilo preukázať.
V našej štúdii sa podarilo overiť vplyv nízkych dávok IR na zmrazené bunky pupočníkovej krvi už od dávky 2 cGy, a zároveň sa nám potvrdilo, že program JCountPro je vhodný na kvantifikáciu radiačne indukovaných fokusov v bunkách po ožiarení nízkymi dávkami IR.
Podporené grantom APVV-0669/10, VEGA (2/0178/11, 2/0109/15) a The Structural Funds of EU (Protonbeam, ITMS: 26220220129).
Bonner, W. M., C. E. Redon, et al. (2008). "GammaH2AX and cancer." Nat Rev Cancer 8(12): 957-967.
Greaves, M. F. and J. Wiemels (2003). "Origins of chromosome translocations in childhood leukaemia." Nat Rev Cancer 3(9): 639-649.
Mori, H., S. M. Colman, et al. (2002). "Chromosome translocations and covert leukemic clones are generated during normal fetal development." Proc Natl Acad Sci U S A 99(12): 8242-8247.
Noon, A. T. and A. A. Goodarzi (2011). "53BP1-mediated DNA double strand break repair: insert bad pun here." DNA Repair (Amst) 10(10): 1071-1076.
Rogakou, E. P., C. Boon, et al. (1999). "Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo." J Cell Biol 146(5): 905-916.
Vokálová, L. (2014). Radiosensitivity and DNA repair in human leukemic and stem cells, Diploma Thesis, Faculty of natural sciences, Comenius University, Bratislava